米乐m6官方网站（AIST；所长：Ryoji Chubachi）环境管理技术研究所测量技术组的 Masaki Torimura（组长）和 Sung-Bae Kim（高级研究员）通过人工设计创造了超发光荧光素酶，可大大延长生物发光时间。 AIST 研究了源自发光浮游生物（桡足类）的荧光素酶，其动机是分子量小且发光强。在本研究中，研究人员对多种桡足类荧光素酶的氨基酸序列进行了比对，并鉴定了频繁出现的氨基酸，并根据其独特的想法（所制作的序列内部的多重序列比对规则）进一步重新排列，最终开发出了一系列与天然荧光素酶在遗传上不同的独特荧光素酶。考虑到所制备的荧光素酶与天然生物来源的荧光素酶不同，因此将其命名为人工荧光素酶（ALuc）。 ALuc 的亮度比传统荧光素酶高出 100 倍，并表现出出色的发光可持续性（半衰期：20 分钟）。

使用传统荧光素酶在多种测定系统中对制备的 ALuc 进行检查（报告基因测定、双杂交测定和活体生物成像）。结果表明，ALuc 在提高灵敏度、缩短测量时间以及活体组织的透光性方面优于任何传统荧光素酶。目前ALuc作为发光标记物的发展将有助于生命科学的基础研究，并有望进一步促进因灵敏度和测量速度差的问题而受到限制的各种诊断：例如医院医疗诊断领域中生物标记物的高通量筛选、家庭个人保健以及环境诊断领域中水和食物中内分泌干扰化学物质的高灵敏度分析。

本研究的一部分是在 AIST 内部项目“亚洲战略—水资源项目”（2012-2013 财年）中进行的。这项技术的详细信息将在线发表在美国科学期刊上，生物共轭化学，在不久的将来。

开发的人工荧光素酶（ALuc）

自2008年下村修博士荣获诺贝尔化学奖以来，随着公众对生物发光的认识不断加深，生物发光在生命科学、医疗诊断、环境监测等领域的应用日益得到公众的共识。

生物分子的发光大致可分为由外部光能激发引起的发光（荧光）和由化学反应能量激发引起的发光（化学发光）。荧光测量在紧凑性和测定简单性方面存在局限性，因为它需要激发光源、滤光片等。在生物发光作为化学发光的典型类型的情况下，荧光素酶（例如源自萤火虫的荧光素酶）被用作将化学能转化为光的催化手段。然而，这些荧光素酶由于亮度和发光可持续性较差，其工业应用受到限制。

与广泛用作化学发光标记不同，源自萤火虫的荧光素酶（萤火虫荧光素酶或 FLuc）和海堇 (海肾荧光素酶，或RLuc)在信号可靠性和长时间测量方面仍然存在问题，这主要是由于发射信号微弱和不稳定造成的。传统的桡足类荧光素酶（GLuc和MpLuc1）也存在与发射稳定性和亮度相同的问题。为了解决这些问题，研究人员尝试创建携带最佳氨基酸的人工荧光素酶，而不是直接使用源自发光生物体的天然荧光素酶。

由于 AIST 研究人员最近发现了许多桡足类荧光素酶，因此对序列进行了多次比对，以识别最常出现的氨基酸。发现的共有氨基酸被用来创建一系列人工荧光素酶。一些创建的荧光素酶被发现具有很高的光学强度和稳定性。

自2011年起，AIST注意到发光在标记方面的潜在工业价值，对海洋动物荧光素酶的光学特性及其发光机制进行了基础研究。在本研究中，研究人员首先回顾了从桡足类动物中获得的常规荧光素酶的氨基酸序列特征，并重新分析了它们的功能。

据信，更频繁出现的氨基酸是在长期进化过程中通过自然选择而幸存下来的结果，因此将有助于整个序列的热力学稳定性。通过对10多种桡足类荧光素酶的氨基酸进行比对，研究人员可以从频繁氨基酸序列填充的区域中获得热力学稳定的完整氨基酸序列。此外，研究人员发现桡足类荧光素酶由两个负责酶催化反应的共有结构域组成。研究人员还发现，共识域的同质性增加可以提高光学性能（亮度和稳定性）。

基于上述发现，研究人员创建了一系列由提取的关键氨基酸连接而成的人工荧光素酶（ALucs），它们与现有的荧光素酶显着不同。 ALuc的氨基酸序列与传统荧光素酶的氨基酸序列有很大不同，与现有荧光素酶相比，序列同一性通常低于70%（图1左）。人们发现，制造的荧光素酶在光学亮度、发射波长、发光可持续性、底物特异性、耐热性、细胞外分泌等方面都有自己的特点。荧光素酶的各种光学特性使研究人员能够生成适合不同检测目的和环境的最佳检测系统。特别是，具有出色光强度和可持续性的酶对于提高诊断的灵敏度和通量特别有用。

通过以下方法检验了所制备的 ALuc 作为发光标记的优点：

(1) 当将荧光素酶基因引入动物细胞并同等表达时，ALuc 比传统荧光素酶（GLuc 和 RLuc86-535）中最亮的荧光素酶（GLuc 和 RLuc86-535）亮约 100 倍（图 1 右），稳定性高达 7 倍。

(2)制备抗体并用本发明的荧光素酶标记以测量医学诊断中的疾病标志物(抗原)。生成该 ALuc 标记抗体，并将其光学强度与传统 HRP 标记抗体的光学强度进行比较。发现 ALuc 标记的抗体（3 型）比 HRP 标记的抗体亮大约 2 倍（图 2 (A)）。此外，ALuc 发射的生物发光波长比 HRP 更长，这比短波长的生物发光具有更好的组织渗透性（生物成像）。

(3) 为了估计人类压力水平，研究人员开发了一种包含 ALuc 和压力激素（皮质醇）受体配体结合域的单链发光探针。该探针比使用 GLuc 的探针表现出更亮的生物发光，因此甚至可以测量人类唾液中的应激激素（图 2(B)）。

(4) 二杂交测定可用于测量化学物质的转录活性（环境测定）和确定蛋白质-蛋白质相互作用（生命）。当化学物质的转录活性或科学感兴趣的蛋白质-蛋白质相互作用发生时，报告基因被设计为表达，因此表达的报告基因的光强度定量地代表化学物质的浓度或蛋白质-蛋白质相互作用的影响。在相同条件下，ALuc 产生的亮度比 GLuc 更高（图 2(C)）。

图1：人工荧光素酶（ALuc）和高亮度荧光素常规酶的比较

图2：ALuc 在生物测定中发光标记的应用 (A) ALuc 发光用作抗体标记的示例。 1、2 和 3 型是使用不同抗体生产方法生产的发光抗体。 (B) 单链型生物发光探针的工作原理。 ALuc 被分成两部分并暂时停用。应激激素导致分裂的 ALuc 折叠成其原始形式，从而恢复 ALuc 的发光活性。 (C) 使用 ALuc 进行发光标记的双杂交测定示例。当因子转录被激活时，报告基因就会表达。

ALuc目前的发展引发了对未来其他新型高性能酶的期望，而不仅仅是发现天然酶。与荧光素酶开发相关的未来目标包括确定荧光素酶的三维结构、创造更多红移生物发光以在活体组织中获得更好的光学渗透性以及开发大规模生产方法。同时，本实施例有望通过进一步调整实验条件，包括受ALucs三维结构分析启发的氨基酸修饰，荧光素酶在诊断领域的进一步新兴应用。对于新兴用途，研究团队将与希望销售符合工业需求的光学标记的公司推进联合研究。此外，研究人员希望提供先进的荧光素酶技术，通过使光检测设备更小、更便携作为支持技术，并通过 ALuc 技术开发测试套件和试纸，为家庭中的广泛个人提供便利，而不仅仅是在医疗保健和环境测量设施中。