独立行政机构国立产业技术综合研究所[理事长中钵良二]（以下简称“AIST”）环境管理技术研究部[研究部主任陶弘明]测量技术研究组研究组组长鸟村正树、首席研究员金成培具有极高的亮度和优异的持久发光性生物发光我们成功地人工设计和开发了一种酶。 AIST已经进行了一段时间的研究，重点关注来自发光浮游生物（桡足类）的发光酶具有较小的分子量并表现出很强的发光强度。这次，桡足类中大量发光酶的氨基酸序列，我们确定了最常见的氨基酸，并将其与我们自己的想法结合起来（多重对齐规则）重新排列酶，我们创建了一组不同于传统天然荧光素酶的荧光素酶。由于它与自然界生物体中发现的天然发光酶不同，因此被称为“人造”。生物发光酶（人工荧光素酶;阿卢克）”。 ALuc 的亮度比已知的发光酶高出 100 倍，并且具有出色的发光持久性 (半条命：20 分钟）。
使用现有生物发光酶的各种测定系统（报告基因检测、双杂交检测、生物成像等）中使用ALuc进行测试的结果发现，在提高灵敏度、缩短测量时间以及生物组织的光学透明度方面，它比现有产品具有极高的优势。最近开发的ALuc作为发光酶不仅有助于生命科学领域的基础研究，而且还将其应用范围扩大到以前因灵敏度和速度等问题而被放弃的各种诊断，例如医院的高速诊断标志物筛选和家庭健康状况自我管理等医疗诊断领域，以及水和食物中内分泌干扰化学物质的高灵敏度分析等环境诊断领域。
这项研究和开发的一部分是在 AIST 内部项目“亚洲战略水项目”（2012-2012 财年）中进行的。有关该技术的更多信息，请参阅《美国科学杂志》生物共轭化学
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| 本次开发的人工生物发光酶ALuc |
随着2008年诺贝尔化学奖授予下村修博士，不仅公众对生物发光现象更加感兴趣，而且生物发光在生命科学、医学诊断、环境诊断等领域更广泛应用的势头也越来越大。
生物分子的发光现象大致可分为受外界光能激发而发光的现象（荧光）和受化学反应能量激发而发光的现象（化学发光），但荧光测量需要激发光源和光学滤光片，在小型化和简单化分析方面受到限制。此外，生物化学发光是化学发光的一种，利用发光酶（例如萤火虫衍生的发光酶）作为催化剂分子将化学能转化为光，但其在亮度和发光可持续性方面的工业应用受到限制。
源自萤火虫的发光酶，已广泛用作发光标记的发光酶（萤火虫荧光素酶; FLuc) 和海肾衍生的发光酶 (海肾荧光素酶; RLuc）亮度低，发光信号缺乏稳定性，这给信号可靠性和长期测量带来了问题。此外，传统的桡足类荧光素酶（GLuc和MpLuc1）存在发光稳定性和亮度问题。为了克服这些问题，我们放弃了直接使用天然发光动物中发现的发光酶的方法，并尝试创建由最佳氨基酸制成的人工生物发光酶。
近年来，我们利用AIST发现的多种桡足类发光酶，并根据其多重比对信息，以频繁出现的氨基酸为中心重建其序列，创建了一系列人工生物发光酶。在这些生物发光酶中，发现了极其明亮且持久的发光酶。
自2011年起，产业技术研究所着眼于发光标签的产业价值，一直致力于海洋动物来源的发光酶及其发光机制的基础研究。在这项研究中，我们首先仔细检查从桡足类动物收集的现有发光酶的氨基酸序列，并重新分析它们的功能。
在漫长的进化过程中，大量出现的氨基酸通过自然选择得以幸存，因此被认为有助于热力学稳定性。事实上，当比较10多种桡足类酶的氨基酸序列时，发现存在许多频繁出现的氨基酸分布的区域，并且可以提取热力学稳定的氨基酸序列。此外，研究人员发现桡足类酶含有两个相似的控制酶催化反应的区域，通过修改氨基酸序列来改善这些相似性，可以显着提高发光性能（亮度、稳定性）。
基于这些发现，我们将必需氨基酸连接在一起，并创建了一组与现有发光酶显着不同的人工生物发光酶（ALuc）。这些氨基酸序列与已知的发光酶显着不同，序列同源性低于70%（图1，左）。此外，这些酶在发光亮度、发光波长、发光持久性、底物特异性、耐热性和细胞外分泌方面具有多种独特的特性，并且这种多样性有助于根据测定目的和使用环境构建最佳系统。特别是，具有前所未有的超高亮度和出色的持久发光的酶对于提高诊断的灵敏度和通量非常有用。
使用以下方法验证了新开发的ALuc作为发光标记分子的有用性。
(1) 当将荧光素酶基因引入动物细胞以表达相同量的荧光素酶时，ALuc 的亮度高达约 100 倍（图 1 右），并且发光持续时间比现有最亮的荧光素酶（GLuc 和 RLuc86-535）长约 7 倍。
(2)在医疗诊断等中，为了测定疾病标记分子(抗原)，制备与这些分子结合的抗体并用发光酶进行标记。我们创建了一种以 ALuc 作为发光标记的原型抗体，并将其用于通用目的辣根过氧化物酶与标记抗体比较的结果是，ALuc 标记抗体（3 型）的亮度约为其两倍（图 2(A)）。此外，ALuc具有较高比例的长波长光发射，比HRP具有更好的生物组织光穿透性（生物成像）。
(3) 为了衡量一个人承受的压力程度，ALuc和压力荷尔蒙(皮质醇)单分子发光探针它发出的光比使用 GLuc 的光亮度更高，甚至可以测量人类唾液中的应激激素（图 2（B））。
(4) 二杂交检测用于测量化学物质的转录活性（环境诊断）和分析蛋白质之间的相互作用（生命科学）。当化学物质存在转录活性或蛋白质相互作用时，就会产生报告基因，并且根据报告基因（发光标记）的发光强度来定量化学物质的浓度和蛋白质相互作用的强度。在相同条件下，使用 ALuc 的光比使用 GLuc 的光亮度更高（图 2（C））。
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| 图1“人工生物发光酶（ALuc）”与“传统最高亮度发光酶”的比较 |
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| 图 2生物测定 |
(A) 用作抗体标记的示例。 1、2 和 3 型代表具有不同抗体生产方法的发光抗体。
(B) 单分子生物发光探针的工作原理。将 ALuc 分成两部分并暂时使其失活。应激激素导致分裂的 ALuc 折叠回原来的形状，恢复其发光活性。
(C) 使用 ALuc 作为发光标记的双杂交测定示例。当转录因子被激活时，报告基因就会被表达。 |
生物发光酶的发展提高了人们的期望，即不仅有可能像过去那样发现天然酶，而且我们将能够创造出未来需要的高性能酶。发光酶开发的未来挑战包括阐明其三维结构、更长的发射波长以更好地渗透到活组织中，以及开发大规模生产方法。另一方面，关于发光酶在诊断领域的应用，基于本文介绍的例子，通过调整基于三维结构的氨基酸修饰等详细条件，预计实用性将进一步提高。为此，我们将与能够提供满足工业需求的产品组的公司进行联合研究。此外，通过使外围技术变得更小、更便携，以及制造测试套件和测试条，我们将继续开发，以便它可以更容易地被更多人使用，不仅在医疗机构和环境测量机构，而且在家庭中。