药物发现生物技术研究所（BRIDD；所长：Masanao Oda）的 Hiroaki Tateno（高级研究员）和 Jun Hirabayashi（首席高级研究员）、日本国立先进产业技术研究所（AIST；所长：Ryoji Chubachi）以及干细胞工程研究小组的 Yasuko Onuma（高级研究员）和 Yuzuru Ito（组长），产业技术研究院 BRIDD 与和光纯药工业株式会社生命科学研究所、开发本部一、实验室特种化学品部（总裁兼首席执行官：小畠真三）合作，开发了一种技术，可消除移植细胞中可能致瘤的人类诱导多能干细胞和胚胎干细胞 (hiPSC/ESC)。

由 hiPSC/ESC 分化产生的移植细胞可能含有未分化的残留 hiPSC/ESC。这些 hiPSC/ESC 具有致瘤潜力，这是将基于 hiPSC/ESC 的技术应用于再生医学的一大障碍。然而，所开发的技术可以有效消除移植细胞中残留的 hiPSC/ESC，因此有望提高使用 hiPSC/ESC 产生的移植细胞进行再生医学的安全性。

这项技术的详细信息已在线发表在美国科学杂志上，干细胞报告，2015 年 4 月 9 日（美国东部时间）。

从移植细胞中消除潜在致瘤性 hiPSC/ESC 的技术摘要

hiPSC/ESC 具有无限增殖（自我更新）和分化成任何细胞类型的潜力，例如心肌细胞或神经元（多能性）；因此，社会对它们寄予厚望，希望它们成为可能彻底治愈各种疾病的再生医学的细胞来源。然而，将所有 hiPSC/ESC 分化为目标细胞类型是很困难的，并且在某些情况下，可能会残留一定数量的未分化 hiPSC/ESC。由于这些细胞在移植到患者体内时可能会消除肿瘤，因此在移植前有必要对其进行清除。在常用于此目的的传统技术中，移植细胞被分离成单个细胞，然后使用称为细胞分选仪的特殊设备从其中去除残留的 hiPSC/ESC。然而，该技术存在一些问题，例如不能应用于细胞片等；处理速度慢；并且可能会损害移植细胞的存活。为了解决这些问题，需要一种安全、可靠且简单的技术来消除移植细胞中残留的 hiPSC/ESC。

AIST 开发了凝集素微阵列技术，能够对高密度覆盖细胞表面的聚糖进行快速、高灵敏度的分析。特别是近年来，产业技术研究所致力于开发利用凝集素微阵列对hiPSC/ESC表面的聚糖进行综合分析，从而进行干细胞的质量评价和筛选的技术（产业技术研究所的研究结果于2011年6月22日公布）。结果，AIST发现凝集素（碳水化合物结合蛋白）之一rBC2LCN与hiPSC/ESC特异性结合，随后与和光纯药工业合作开发了一种试剂，可以利用rBC2LCN的结合能力对活的hiPSC/ESC进行染色。此外，对rBC2LCN与hiPSC/ESCs结合机制的分析表明，rBC2LCN与糖蛋白podocalyxin上的特定O-聚糖结合（AIST 新闻稿，2013 年 3 月 19 日）。随后的研究表明足萼蛋白由各种类型的 hiPSC/ESC 分泌到培养基中。基于这一发现，AIST开发了一种利用细胞培养基轻松检测移植细胞中残留的hiPSC/ESC的技术（AIST研究结果于2014年2月17日公布）。

这项研究和开发是 AIST 和和光纯药工业公司（从 2011 财年开始）之间的合作研究，由该公司资助。

在这项研究中，发现rBC2LCN与hiPSC/ESC结合后内化到它们中。基于这一发现，研究人员开发了一种重组凝集素-毒素融合蛋白，其中rBC2LCN的C端与铜绿假单胞菌外毒素融合，当其内化到细胞中时，通过抑制蛋白质合成来诱导细胞死亡。

图1显示了用纯化的凝集素-毒素融合蛋白处理24小时后人诱导多能干细胞(hiPSC)的显微图像。活细胞的细胞质和死细胞的细胞核分别被绿色荧光物质和红色荧光物质染色。当培养基不含凝集素-毒素融合蛋白（0 µg/mL）时，许多 hiPSC 附着在培养皿上，并且可检测到绿色荧光，但没有红色荧光，表明大多数 hiPSC 是活的。

另一方面，当培养基含有10 µg/mL凝集素-毒素融合蛋白时，大多数细胞失去附着于培养皿的能力并漂浮在培养基中。即使附着在培养皿上的少量细胞也显示出红色荧光，这表明只有死细胞。这一结果表明大多数 hiPSC 死亡。在用凝集素-毒素融合蛋白处理的人类胚胎干细胞中观察到了相同的效果。这些结果表明，新开发的凝集素-毒素融合蛋白可以有效消除各种类型的未分化hiPSC/ESC。

图1：凝集素-毒素融合蛋白对hiPSC的影响 相差（左）、绿色荧光（中）和红色荧光（右）分别显示实际细胞形状、活细胞和死细胞。

为了对分化细胞产生影响，使用凝集素-毒素融合蛋白 (10 µg/mL) 处理视黄酸 (RA) 分化的 hiPSC、真皮成纤维细胞和脂肪来源的间充质干细胞。几乎所有被研究的细胞都显示绿色荧光，但不显示红色荧光，表明分化的细胞是活的（图2）。这一结果表明，凝集素-毒素融合蛋白选择性消除未分化的 hiPSC/ESC，而不影响分化体细胞的增殖和存活。

消除开发的凝集素-毒素融合蛋白可以选择性地未分化hiPSCs/ESCs，而不影响培养中的分化细胞，只需将蛋白质添加到培养基中，无需对细胞进行解离等预处理，并且可用于大量细胞和细胞片层。预计它将用于各种应用，包括生成用于再生医学的移植细胞和用于药物发现筛选的细胞制备。

图2：凝集素-毒素融合蛋白对分化细胞的影响 相差（左）、绿色荧光（中）和红色荧光（右）分别显示实际细胞形状、活细胞和死细胞。

凝集素-毒素融合蛋白计划在一年内投入实际应用，作为消除 hiPSC/ESC 的试剂。研究人员将通过评估融合蛋白是否可以应用于再生医学细胞（例如源自 hiPSC 的心肌细胞或神经元），为使用 hiPSC/ESC 生成的移植细胞提高再生医学的安全性做出贡献。