米乐m6官方网站（AIST；院长：Ryoji Chubachi）生物生产研究所（所长：Yoichi Kamagata）的 Takema Fukatsu（首席高级研究员兼共生进化和生物功能研究组组长）、Yoshitomo Kikuchi（环境生物功能研究组高级研究员）等人与韩国釜山国立大学合作韩国，一种肠道共生细菌，对豆虫的生长和繁殖有有益作用（行人裂口鱼) 被称为大豆害虫，在共生条件下以细胞内颗粒的形式积累聚羟基脂肪酸酯 (PHA)（一种聚酯），并且这种细胞内聚酯积累是维持正常共生关系所必需的。

许多细菌从糖和脂质中合成大量 PHA（有时超过细菌干重的 90%），在细胞内积累 PHA 颗粒作为碳储存，以在饥饿和环境压力期间生存。另一方面，PHA作为一种生物塑料材料引起了研究人员的关注。 AIST 发现 PHA 参与维持昆虫-细菌共生关系，这不仅在生物学上很有趣，而且还揭示了生物技术和共生之间意想不到的联系。

这些结果已在线发表在美国学术期刊上，美国国家科学院院刊，2013 年 6 月 11 日（日本标准时间）。

（左）豆虫Riptortus pedestris。 （中）R。行人，其后部专门作为共生器官（黄色箭头），用于容纳特定的细菌共生体。 （右）可以看到共生细胞因此积累的 PHA 颗粒（红色箭头）。

微生物比动植物更加多样化，其复杂的生物功能已被用于生产医药、农药、食品、燃料和清洁剂等多种用途，从而支持人类的生命并创造巨大的经济效益。近年来，与动植物共生、具有多种复杂生物学功能的共生细菌作为“未开发的生物资源”而备受关注。此外，由于微生物来源的生物塑料可回收和生物降解，原则上不消耗化石燃料，因此可能涉及较低的环境负荷，因此世界范围内不仅推动生物塑料的基础研究，而且推动生物塑料的应用和商业化。

AIST 已发表了许多关于与多种昆虫相关的共生细菌的各种生物学功能的研究成果，其中包括共生体介导的植物适应、害虫进化和杀虫剂抗性（AIST 新闻稿2004 年 3 月 25 日, 2007 年 6 月 13 日，并且2012 年 4 月 24 日) 以及复杂的宿主-共生体相互作用，包括营养供应、繁殖操纵和垂直传播（AIST 新闻稿于 2009 年 12 月 22 日，AIST 研究结果于 2007 年 7 月 3 日和 2012 年 5 月 28 日公布）。

大多数共生细菌在其生命周期中没有自由生活阶段。然而，研究人员发现豆虫 (行足裂口鱼)，被称为大豆害虫，获得该属的细菌共生体伯克霍尔德杆菌若虫阶段来自土壤，并在位于消化道后部区域的共生器官中藏有共生体。共生体对宿主的健康具有有益的影响，包括更快的生长、更大的体型和更多的产蛋量。此外，反映了它在环境土壤中的自由生活，伯克霍尔德杆菌共生体很容易培养并且可以进行基因操纵。因此出现了豆子错误并且伯克霍尔德杆菌包含一个有用的模型实验系统，用于阐明共生的分子机制。 AIST 专注于豆虫的共生系统和伯克霍尔德杆菌，与昆虫生物化学和免疫学领域杰出专家韩国釜山国立大学Lee Bok Luel教授团队启动国际联合研究项目（AIST TODAY Vol12 No4）。

这项研究得到韩国国家研究基金会全球研究实验室计划的支持。

试图识别参与豆虫和伯克霍尔德杆菌，研究人员准备了共生伯克霍尔德杆菌来自宿主肠道的细胞和非共生伯克霍尔德杆菌在营养培养基中培养的细胞，提取、分析和比较其蛋白质，并鉴定出在共生条件下过量产生的蛋白质（图1A）。氨基酸测序鉴定出过度表达的蛋白为 PhaP 蛋白，已知该蛋白可与 PHA 颗粒结合。这些结果表明PHA颗粒是在共生条件下积累的。电子显微镜和荧光成像证实共生伯克霍尔德杆菌共生条件下的细胞在培养时含有发育良好的 PHA 颗粒（图 1B）伯克霍尔德杆菌细胞含有发育不良的 PHA 颗粒（图 1C）。

图1：(A)从共生体中提取的蛋白质的比较伯克霍尔德杆菌有文化伯克霍尔德杆菌。在共生条件下优先检测到分子量约为 19,000 的蛋白质条带（黑色箭头）。 (B) 共生体的电子显微镜图像伯克霍尔德杆菌细胞，然后看到发育良好的 PHA 颗粒（红色箭头）。 (C) 培养物的电子显微镜图像伯克霍尔德杆菌细胞因此 PHA 颗粒发育较差（红色箭头）。

在细菌细胞内，PHA 通过三种酶促反应合成（酶分别是 PhaA、PhaB 和 PhaC 蛋白）（图 2A）。研究人员生成伯克霍尔德杆菌编码PhaB蛋白的phaB基因或编码PhaC蛋白的phaC基因被破坏的菌株。豆虫被 phaB 破坏伯克霍尔德杆菌菌株，phaC 破坏伯克霍尔德杆菌菌株，野生型伯克霍尔德杆菌菌株，或一个伯克霍尔德杆菌编码 PhaP 蛋白的 phaP 基因被破坏的菌株，尽管它与 PHA 颗粒结合，但不参与 PHA 合成（图 2B）。在野生型菌株和phaP破坏的菌株中，观察到宿主肠道的正常定植、高密度的正常感染以及细胞内PHA颗粒的正常积累(图3A、3B和3E)。相比之下，在 phaB 和 phaC 破坏的菌株中，PHA 颗粒几乎不积累，并且宿主肠道中的感染密度非常低（图 3C-E）。此外，与感染野生型株或phaP破坏株的宿主昆虫相比，感染phaB破坏株或phaC破坏株的宿主昆虫表现出较不发达的共生器官和较小的体型。 （图 4A-D 和图 5）。

图2：(A) PHA的合成途径。 (B) 实验设计伯克霍尔德杆菌接种测试。

图3：(A)-(D)野生型电子显微镜图像比较伯克霍尔德杆菌菌株和突变体伯克霍尔德杆菌PHA 相关基因被破坏的菌株。红色箭头表示 PHA 颗粒。 (E) 野生型感染密度比较伯克霍尔德杆菌菌株，突变体伯克霍尔德杆菌PHA相关基因破坏的菌株和突变体伯克霍尔德杆菌重新引入被破坏的 PHA 相关基因的菌株。

图4：野生型感染宿主共生器官的外观伯克霍尔德杆菌应变，伯克霍尔德杆菌具有 PHA 相关基因破坏的菌株，以及伯克霍尔德杆菌重新导入被破坏的PHA相关基因的菌株。当共生体感染密度较高时，器官会出现肿胀和发白。

图5：感染野生型的雌性成虫的体重伯克霍尔德杆菌应变，伯克霍尔德杆菌PHA 相关基因被破坏的菌株，以及伯克霍尔德杆菌重新引入被破坏的 PHA 相关基因的菌株。

接下来，研究人员使用编码正常 phaB 或 phaC 基因的质粒，从基因上补充了 phaB 和 phaC 破坏的基因伯克霍尔德杆菌菌株，从而产生重新引入的phaB和phaC伯克霍尔德杆菌菌株。然后宿主昆虫被其中一种共生菌株感染，其中还包括含有空白质粒的野生型菌株和重新引入 phaP 的菌株。在phaB和phaC重新引入的菌株中，PHA颗粒的积累、宿主肠道中的感染密度、宿主共生器官的发育和宿主昆虫的体型都恢复到与野生型菌株和phaP重新引入的菌株观察到的相同水平（图3E、4F、4G和5）。

为什么 PHA 颗粒的积累在豆虫中起着重要作用-伯克霍尔德杆菌共生？一种可能的解释被提出为“共生体介导的应激抵抗”假设，如下。伯克霍尔德杆菌细胞以非常高的密度隐藏在宿主共生器官中（图1B、3A和3B），并且它们在宿主体内的生长速度非常缓慢。因此，在宿主的生命周期中大约两个月，共生伯克霍尔德杆菌可能会受到高密度共生和生长控制（例如宿主的免疫调节）引起的环境压力。因此，尽管是推测，但预计 PHA 颗粒的积累可能会提供共生伯克霍尔德杆菌具有抗压能力。实际上，当在实验中遭受营养耗尽、高温和高渗透压等环境压力时，phaB-和phaC-会被破坏伯克霍尔德杆菌菌株容易受到应激处理的影响，而 phaB- 和 phaC- 则被重新引入伯克霍尔德杆菌菌株具有抗药性（图 6）。

图6：野生型的存活率伯克霍尔德杆菌应变，伯克霍尔德杆菌PHA 相关基因被破坏的菌株，并且伯克霍尔德杆菌在胁迫条件下重新引入被破坏的PHA相关基因的菌株。 (A) 磷酸盐缓冲溶液中两天（饥饿）。 (B) 45 ℃ 浴中 10 分钟（热休克）。 (C) 24小时内1摩尔葡萄糖溶液（高渗透）。

研究人员计划进一步研究 PHA 如何与豆虫和豆虫之间共生关系的建立和维持相关的机制伯克霍尔德杆菌，通过缩小共生胁迫因素，综合分析基因表达、功能分析，以及共生相关和PHA积累相关基因的鉴定和分析。

这项研究表明，PHA 积累与细菌的共生能力有关，或在宿主生物体内耐受高密度条件，这导致了这样一种可能性：通过遗传引入和/或强化 PHA 合成途径，有可能赋予细菌在宿主内的稳定性和维持，特别是用于益生菌目的的肠道细菌。研究人员也计划从这样的应用角度进行研究。