- 开发天然荧光素的修饰形式，使用免疫球蛋白 G (IgG) 作为发光反应的催化剂
- 成功根据IgG的结构改变发射颜色
- 由于可以快速、轻松地测定变性程度，因此有望应用于抗体质量控制
天然荧光素的修饰版本改变发光颜色以反映抗体的结构状态
米乐m6官方网站（以下简称“AIST”）健康与医学工程研究部，首席研究员西原良，技术人员（研究时）木原良树，副教授栗田良二，庆应义塾大学理工学部系统设计工学系山本英二，庆应义塾大学研究生院理工学研究科平野英德这是一种抗体，与特聘副教授合作，广泛用于治疗和诊断免疫球蛋白 G (IgG)反应的发光底物并根据 IgG 的结构改变发光颜色 (荧光素) 被开发出来。
抗体在识别和消灭生物体中的病毒和细菌方面发挥着作用，也广泛用作诊断和治疗剂。然而，抗体在生产、储存和使用过程中容易受到环境影响。转变原有功能将丢失。
在这项研究中，我们首次发现IgG这种抗体具有“伪荧光素酶活性”，可以催化荧光素的发光反应。我们还开发了一种利用该技术检测 IgG 变性的技术。这种新设计和合成的荧光素的发射波长根据 IgG 的结构而变化，因此通过测量它，可以轻松定量地评估 IgG 的变性程度。该方法比传统的荧光分析方法具有更高的灵敏度，只需将开发的荧光素混合即可在3分钟内完成测量。抗体药物为质量控制和诊断药物开发做出贡献。
该技术的详细信息将于 2025 年 4 月 30 日发布。分析化学
IgG等抗体在识别和消除生物体中的病毒和细菌方面发挥着重要作用，也广泛用作诊断和治疗剂。然而，抗体的结构容易受到储存条件和环境的影响，随着变性的进行，原有的功能受到损害。抗体变性影响产品的安全性和有效性，因此必须监测变性的进展。目前，对于抗体变性评估，尺寸排阻色谱 (SEC)、动态光散射 (DLS)被使用。然而，这些分析方法需要专门的知识和技能。因此，需要开发一种能够更容易、更快速地评估抗体变性程度的方法。
AIST 在世界上第一个报告，即使是天然蛋白质，例如萤火虫荧光素酶，原本被认为没有荧光素酶功能，但对具有独特化学结构的发光底物具有假荧光素酶活性*1例如，来自海萤火虫的荧光素是新型冠状病毒的罪魁祸首。刺突蛋白发生特异性反应并发光 (2024 年 1 月 17 日 AIST 新闻稿）。这种发光反应只有在刺突蛋白中才能观察到，因此通过简单地混合荧光素，就可以在1分钟内测量出人类唾液中新型冠状病毒刺突蛋白的浓度。另外，它的准确度是酶联免疫吸附测定 (ELISA)，因此有望被开发为一种全新的蛋白质分析方法。
这次是在海萤火虫的荧光素中发现的咪唑并吡嗪酮环的化学修饰底物类似物与 IgG 结合发光。
此项研发由国家研究开发公司日本科学技术振兴机构 (JST) 战略创意研究促进项目“细胞的动态高阶结构”进行 项目名称：开发构成发光反应场的肽探针 (JPMJPR20EB)（2020-2024 财年）、对非膜结构内部分子行为的分层综合理解（JPMJPR22EE）（2022-2025 财年），日本学术振兴会（JSPS）科学研究补助金“青年科学家”（22K14802）（2020-2024 财年）和“基础研究 B”（22H02114）（2022-2024 财年）支持的独立行政机构。
(1) 与 IgG 发生发光反应的荧光素的设计与合成
10820_11128HOMO-LUMO带隙因此，我们预计IgG的结构变化会影响荧光素的TPA基团并引起发射波长的变化。事实上，合成的荧光素与多克隆抗体 IgG 发生发光反应，多克隆抗体 IgG 是免疫球蛋白的混合物（图 1B），正常 IgG 发出绿光（最大发射波长 539 nm），而热处理变性的 IgG 则发出蓝光（最大发射波长 509 nm）（图 1C）。这是第一个表明 IgG 表现出催化发光反应的“伪荧光素酶活性”的例子。此前，我们将使用人血清白蛋白（HSA）（一种人源性蛋白质）发光的底物命名为“人发光体1（HuLumino1）”*2，我们将一种与人类 IgG 一起发光的新荧光素命名为“HuLumino2”。
图1 (A) HuLumino2 的化学结构 (B) 荧光素与多克隆IgG 之间的发光反应验证：针对HSA 的荧光素HuLumino1 不发生反应，但针对IgG 设计的荧光素HuLumino2 显示出高发光响应。 (C)HuLumino2与正常多克隆IgG或变性多克隆IgG的发射光谱：正常状态下发出绿光，但变性状态下发出蓝光。
*原始论文中的数字被引用或修改。
(2) HuLumino2结合位点的预测
HuLumino2 和全长 IgG 及 3 种类型
IgG 片段(Fc, Fab, F(ab')2)的发光强度的结果表明，全长IgG的发光强度比其他片段IgG高约10倍（图2A）。该测量结果表明，HuLumino2发光反应中涉及的主要催化活性位点仅由全长版本拥有。
铰链区域此外，
分子动力学 (MD) 模拟对IgG和HuLumino2进行相互作用分析，结果预测HuLumino2主要通过TPA基团与IgG的铰链区结合（图2B）。 MD模拟预测了一种分子识别模式，其中HuLumino2与铰链区的疏水部分结合并被特定氨基酸（Tyr306、Pro695、Pro697、Lys787）稳定（图2B）。通过发光测量和MD模拟预测的发光活性位点的铰链区是所有全长IgG中保守的区域，这表明HuLumino2也可能与各种类型的IgG引起发光反应。
图2（A）全长IgG与片段的发光强度比较（B）MD模拟得到的荧光素与IgG的结合模式
*这是对原始论文中的数字的引用或修改。
(3)单克隆抗体(mAb)药物的质量评价
使用单克隆抗体 (mAb) 的药物是同质免疫球蛋白，主要基于 IgG 开发，用作治疗癌症和骨质疏松症等多种疾病的药物。 IgG 有四个亚类（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4），每个亚类重链的氨基酸序列，铰链区特征（长度，二硫键等）是不同的。由于mAb药物是基于IgG1、IgG2和IgG4开发的，因此我们评估了该技术对基于这些亚类的药物的适用性。结果，确认了所有药物的发光活性，但只有 IgG2 显示荧光素的发射波长在正常条件和变性条件之间发生变化。这被认为是因为荧光素仅通过IgG2特有的铰链区的结构变化来改变其发射波长。我们证实，随着热变性 IgG2 的增加，发射波长从绿色变为蓝色（图 3A）。该波长变化宽度的值线性增加，直到变性的IgG2的比例达到20vol%，然后检测限 (LOD)经确认为 18%（图 3B）。使用荧光染料的荧光检测方法有时用于定量变性抗体，但该方法测量荧光强度的变化，这带来了容易受到背景信号影响的问题。本研究开发的发光测定方法使用发射波长的变化作为指标，而不是容易出错的发射强度的波动，从而可以进行更可靠的定量分析。
图3 (A) IgG2药物变性导致的发射波长变化：将各发射光谱的最大发射强度标准化为100。(B) 变性的IgG2含量与最大发射波长变化宽度之间的相关性：相对于正常IgG2最大发射波长的变化值为Δλ最大
*原始论文中的数字被引用或修改。
上述结果揭示了简单地通过混合HuLumino2和IgG来定量检测IgG变性程度的可能性。新开发的方法只需将 IgG 与荧光素混合并读取发光颜色即可在 3 分钟内检测出 IgG 的变性程度。它比SEC和DLS等传统方法更简单、更快速，有望成为评估IgG质量的新手段。
未来，通过进一步优化荧光素的化学结构，我们将开发一种发光分析技术，可应用于其他mAb药物和诊断剂（例如IgG1和IgG4）的变性检测。由于其简单性，该方法只需添加荧光素即可进行快速评估。高通量分析，未来有望应用于各类抗体产品的质量控制和稳定性测试。
已出版的杂志：分析化学
论文标题：免疫球蛋白 G (IgG) 中伪荧光素酶活性的发现及其在 IgG 变性检测中的应用
作者：Ryo Nishihara、Yoshiki Kihara、Eiji Yamamoto、Hidenori Hirano、Ryoji Kurita
DOI：101021/acsanalchem5c00646
*1：Nishihara 等人，“SARS-CoV-2 刺突蛋白的伪荧光素酶活性鲤鱼荧光素”，ACS 中心。科学, 2024, 10, 283-290.
*2：Nishihara 等人，“腔肠素类似物与人血清白蛋白特异性生物发光”，生物共轭化学., 2020, 31, 2679-2684.