- 发现新型冠状病毒的刺突蛋白能够导致Cypridina的发光底物发光
- Cypridina 的发光底物与多种蛋白质共存，但刺突蛋白特异性发光
- 有望成为一种简单快速的新型冠状病毒检测方法
利用 SARS-CoV-2 刺突蛋白本身的酶促功能进行检测
8451_8799刺突蛋白''是Cypridina的发光底物海萤荧光素发光。
这一发现也有望成为检测刺突蛋白的方法。即使在多种蛋白质共存的唾液样本中，Cypridina 荧光素也只与新冠病毒的刺突蛋白发生反应。利用这一现象，我们只需将鲤鱼荧光素与唾液混合，就能在大约 1 分钟内检测到刺突蛋白。该方法有望成为比传统PCR方法和抗原检测更简单、更快速的新型冠状病毒检测技术。
该技术的详细信息将于 2024 年 1 月 17 日（美国东部时间）发布。ACS 中央科学
诊断新型冠状病毒感染的主要方法是扩增检测病毒特征基因的方法（PCR法）和检测病毒蛋白抗原的方法（抗原检测法）。 PCR法灵敏度高，适合明确诊断，但检测时间约2小时，难以快速检测大量标本。此外，即使是简单的抗原测试方法也需要10分钟或更长的测试时间，因此需要比这些传统技术更简单且更快的病毒检测方法。
AIST 在世界上第一个报道了一种不被称为发光酶的蛋白质导致具有独特化学结构的发光底物发光（Nishihara 等人，生物共轭化学., 2020,分析师，2021）。例如，水母水母人血清白蛋白 (HSA)由于该发光反应仅在 HSA 中观察到，因此通过简单地混合底物，可以在约 1 分钟内检测未预处理的人血清中的 HSA 浓度。此外，它的准确性是酶联免疫吸附测定 (ELISA)，因此原则上有望开发为全新的蛋白质分析方法。然而，除HSA之外的蛋白质也具有与假发光酶类似的活性，并且尚未验证该活性是否可以用于分析。因此，这次我们验证了该方法对于新型冠状病毒刺突蛋白的适用性。
这项研究和开发是由日本科学技术振兴机构 (JST) 战略基础研究促进项目“细胞的动态高阶结构（2020-2023 财年）”和独立行政机构进行的。我们得到了日本学术振兴会 (JSPS) 科学研究补助金“青年科学家（2022-2024 年）”和“基础研究”的支持B（2022-2024）”和新能源产业技术综合开发机构（NEDO）“材料创新技术领先研究计划（2021）”和“实现物联网社会的创新传感技术开发（2019-2022）”。
(1) 选择与刺突蛋白引起发光反应的发光底物
为了发现 SARS-CoV-2 刺突蛋白的假发光活性，我们结合使用单体刺突蛋白和 36 种具有不同化学结构的发光底物进行发光测量（图 1A-C）。结果，他们发现刺突蛋白仅与 Cypridina 荧光素（Cypridina 中含有的发光底物）引起发光反应。刺突蛋白由S1和S2蛋白组成，S1蛋白含有受体结合域(RBD)，可与感染细胞上的受体结合。通过测量这些刺突蛋白片段蛋白（降解为S1、S2和RBD的蛋白质）和Cypridina荧光素的发光，我们发现Cypridina荧光素与除RBD区域外的S1和S2蛋白发生酶促反应（图1D）。此外，全长刺突蛋白（单体），包括 S1 和 S2 蛋白，比片段蛋白具有更高的发光强度和底物亲和力（图 1D）。换句话说，Cypridina 荧光素是由 S1 和 S2 蛋白结合产生的。蛋白质结构域界面。
图 1 (A) SARS-CoV-2 刺突蛋白（单体）的结构 [PDB 代码：7FG7] (B) 36 种发光底物和刺突蛋白（单体）的发光响应验证 (C) 鲤鱼荧光素和刺突蛋白（单体）的发光强度时程 (D) 刺突蛋白（单体）和刺突蛋白（单体）的发光强度比较其片段蛋白：S1和S2结合的结构增加了发光强度和对底物的亲和力。
*原始论文“SARS-CoV-2 刺突蛋白的伪荧光素酶活性
鲤鱼Luciferin”插图的引用/修改。
(2) 使用三聚刺突蛋白进行发光测量并预测 Cypridina 荧光素结合位点
新型冠状病毒表面的刺突蛋白以三聚体形式存在。对于三聚体，我们确认 Cypridina luciferin 的发光强度高于单体（图 2A）。这被认为是由于三聚体中发生发光反应的位置（蛋白质结构域的界面）的数量比单体中的数量多。实际上对接模拟预测Cypridina luciferin结合位点，我们发现Cypridina luciferin倾向于结合到三聚体刺突蛋白结构域的界面上（图2B）。
图 2 (A) SARS-CoV-2 刺突蛋白单体和三聚体形式的发光强度比较 (B) Cypridina 荧光素与三聚体刺突蛋白的对接模拟结果 [PDB 代码：6VXX]：Cypridina 荧光素可以在蛋白结构域之间的界面处结合。目前尚不清楚是否所有预测的结合位点都参与发光反应。
*原始论文“SARS-CoV-2 刺突蛋白的伪荧光素酶活性
鲤鱼Luciferin”插图的引用/修改。
(3) 利用伪发光酶功能定量分析刺突蛋白
Cypridina 荧光素不会与唾液中的蛋白质发生反应，包括淀粉酶（图 3A）。此外，Cypridina 荧光素的发光强度取决于刺突蛋白的量（图 3B）。因此，我们使用未加工的唾液作为样本测试了刺突蛋白。额外的恢复测试的结果是，我们只需在添加Cypridina luciferin后测量1分钟的发光强度，就成功地定量了唾液中的刺突蛋白。其准确性与 ELISA 相当（图 3C）。
图3 (A) Cypridina luciferin 与唾液中所含蛋白质的反应性测试 (B) Cypridina luciferin 发光强度对 Spike 蛋白浓度的依赖性 (C) 以唾液为样品的 Spike 蛋白添加和回收测试：与 ELISA 方法比较的结果。
利用新发现的病毒蛋白拟发光酶功能的蛋白质分析方法，可以比传统技术更容易、更快速地定量病毒蛋白，预计未来将作为一种新的病毒测量技术。
未来，我们将优化荧光素的化学结构，开发更灵敏的病毒相关蛋白测量技术。我们还旨在将其作为病毒诊断剂商业化。
已出版的杂志：ACS 中央科学
论文标题：SARS-CoV-2 刺突蛋白的伪荧光素酶活性鲤鱼荧光素
作者：Ryo Nishihara、Hisham M Dokainisch、Yoshiki Kihara、Hiroki Ashiba、Yuji Sugita、Ryoji Kurita
DOI：101021/acscentsci3c00887