米乐m6官方网站（以下简称“AIST”），细胞与分子工程研究部，多细胞系统控制研究组，研究组组长立野弘明，筑波大学人类生物学学位课程研究生。 Sunanda Keisham 在从组织等分离的约 10,000 个细胞中表达聚糖和RNA下一代定序器一次性分析所有内容水滴1型细胞聚糖/RNA测序方法（液滴型）scGR-seq方法）被开发出来。
细胞表面的聚糖被用作各种疾病的药物发现靶标以及再生医学细胞的质量控制。以前我们是DNA 条形码已标记凝集素（糖结合蛋白）与细胞反应，将每个细胞分离到微量离心管中，然后使用下一代测序仪获得每个细胞的细胞外糖链和细胞内RNA表达的信息。然而，采用将一个细胞分配到微量离心管中的传统板式方法，在单个实验中可以分析的细胞数量仅限于几百个细胞。在这项成果中，通过引入液滴技术，可以在一次实验中分析约10,000个细胞，与传统方法相比，可处理的细胞数量增加了约100倍。更全面地分析不同细胞类型之间的差异以及同一细胞类型内细胞表面糖链的多样性变得可能，也使得快速获取仅包含少量细胞的稀有细胞的信息成为可能。
该技术的详细信息将于 2024 年 1 月 2 日公布。小方法
近年来，为了阐明癌症、阿尔茨海默病、生活习惯病等的病理学、开发新药、甚至开发预防方法，获取导致这些疾病的细胞中表达的所有生物分子的信息（组学信息）的技术的发展受到关注。特别是，为了开发实现健康长寿社会所需的新医疗技术，有必要获取每个细胞的组学信息，而不是每个细胞群（整体）的常规信息。这将导致对疾病发病机制的更准确理解，以及针对多细胞相互作用和组织中少量存在的病理细胞的前所未有的新医疗技术的发展。分析每个细胞中 RNA 表达的技术 (scRNA-seq方法）在世界范围内广泛应用，不仅用于基础研究，而且用于新药的开发。
然而，传统的scRNA-seq方法只能分析细胞内的RNA表达，并不能直接分析糖链（糖链）的信息，糖链是位于细胞表面的生物分子。由于糖链高度多样化且具有支链结构，其分析需要大量的时间和精力，因此很难快速分析许多样品。因此，糖链尚未在药物发现和医疗保健中得到充分利用。
AIST 多年来一直致力于开发糖链分析技术 (2011 年 6 月 22 日 AIST 新闻稿）。通过分析干细胞、癌细胞等中表达的糖链，我们不断开发干细胞和候选药物的质量控制技术。2013 年 3 月 19 日、2014 年 2 月 17 日、2015 年 4 月 10 日、2017 年 9 月 26 日 AIST 新闻稿）。
AIST 旨在开发新的糖链分析技术，以支持健康社会的基础技术开发，最近开发了一种技术（scGR-seq 方法），可使用 DNA 条形码标记的凝集素和新一代测序仪同时分析每个细胞中表达的糖链和 RNA 的表达。2021 年 7 月 27 日 AIST 新闻稿）。然而，传统的 scGR-seq 方法存在一次只能分析几百个细胞的问题，这是构成组织的少量细胞。因此，还不可能全面分析构成组织的各种细胞类型。这次，我们开发了一种液滴型scGR-seq方法，将液滴技术融入到scGR-seq方法中。结果，我们成功地将处理的细胞数量增加了约 100 倍（约 10,000 个细胞）。这项研究和开发得到了国家研究开发机构PRESTO的“集成单细胞分析创新技术平台”（2016-2019年）、“A-STEP产学界合作（开发型）”（2020-2022年）以及独立行政机构日本学术振兴会的支持。我们得到科学研究补助金“基础研究（B）”和“学术转化领域研究（B）”（自2023年起）的支持。
这次，我们设计了一种融合了液滴技术的scGR-seq方法，并开发了一种液滴型scGR-seq方法，可以在单次实验中获得每个细胞约10,000个糖链和RNA表达数据。图1显示了实验流程。我们选择了 30 种具有不同糖结合特异性的凝集素，并通过在每种凝集素上附加独特的短碱基序列标记（DNA 条形码）来创建 DNA 条形码标记的凝集素。然后，利用液滴技术，使用微通道将一个细胞和一个珠子封装在一种乳液中。这些珠子含有不同的 DNA 条形码作为细胞标记（细胞标签），从而可以识别从每个细胞获得的信息。细胞标签包含被修饰为凝集素的 DNA 条形码和与 mRNA 结合的碱基序列。通过使用 PCR（聚合酶链式反应）放大与细胞标签结合的 DNA 条形码和 mRNA 信息，我们使用下一代测序仪分析了与单个细胞结合的凝集素分子以及 mRNA 的类型和相对数量。这使我们能够同时获得每个细胞的糖链和基因表达信息。
图1 液滴型单细胞聚糖/RNA测序方法（scGR-seq方法）的流程
*这是对原始论文中的数字的引用或修改。
利用这项技术，我们分析了人类血液中约 10,000 个外周血单核细胞中糖链和 RNA 的表达。使用获得的每个细胞的糖链和RNA的综合数据（约8000个细胞的最终数据）UMAP的统计分析方法对细胞进行分类的结果（统一流形近似和投影），我们发现它们被分为两大类：淋巴和骨髓（图2A）。换句话说，这表明糖链和RNA的表达在淋巴系和骨髓系之间存在显着差异。此外，利用糖链和RNA这两个组学信息，T细胞（CD4+T，CD8+T)、记忆B细胞、单核细胞（经典、中间和非经典）、树突状细胞（DC、pDC）和血小板（图2A）。通过添加糖链信息，我们能够识别 pDC（浆细胞样树突状细胞），这是一种罕见的细胞，仅在血液中少量存在，仅使用 RNA 信息无法识别。
每个细胞的糖链谱（凝集素反应模式）如图 2B 所示。发现每种细胞类型的聚糖谱都不同。换句话说，每种细胞类型表达不同的聚糖。此外，我们发现即使在相同的细胞类型中，每个细胞的聚糖谱也存在多样性。
图2 外周血单个核细胞分析
A：使用糖链和 RNA 的集成数据对细胞进行分类。 wnnUMAP_1、wnnUMAP_2：每个数据集的主成分被压缩为二维时的正交成分。
B：每个细胞的糖链概况热图。黄色：强反应性，黑色：中等反应性，紫色：弱反应性。
*这是对原始论文中的数字的引用或修改。
接下来，我们搜索了与每种细胞类型发生特异性反应的凝集素（图 3A）。TJAII与其他细胞类型相比，与血小板的反应更强烈。这是分析细胞的常用方法流式细胞术获得了类似的结果方法。当我们研究 TJAII 与血小板上的哪种糖蛋白发生反应时，我们发现GPIbα的血小板特异性糖蛋白发生强烈反应。 GPIbα 是血管性血友病因子 (vWF) 已知会导致血液凝固。当使用称为岩藻糖苷酶的糖基水解酶去除血小板上的 α1,2 岩藻糖时，对 vWF（荧光强度）具有高反应性的血小板百分比从 132% 增加到 203%（图 3B）。这表明血小板上的α1,2岩藻糖在血液凝固中起着重要作用。
图3 与每种细胞类型发生特异性反应的凝集素的鉴定和功能分析
A：鉴定与每种细胞类型发生强烈反应的凝集素。红色：强反应性，白色：中等反应性，蓝色：弱反应性。
B：vWF 对岩藻糖苷酶处理和未处理的血小板的反应性。黑线：对照抗体的反应性，蓝线：vWF抗体的反应性
*原始论文中的数字被引用或修改。
这样，通过使用新开发的液滴型scGR-seq方法，现在可以一次获得约10,000个单个细胞的糖链和基因表达信息。除了获得血液中发现的每种不同细胞类型的聚糖谱外，我们还阐明了每种细胞类型中表达的特征聚糖。
未来我们将在社会上实施液滴式scGR-seq方法，以普及该技术。此外，我们还将把这项技术应用到医疗保健领域。例如，通过分析病变组织，我们可以识别病变细胞等药物靶点。此外，通过分析不同年龄的正常组织，我们将开发可视化衰老和疾病进展的技术，并开发预防技术。此外，通过分析再生医学用细胞，我们的目标是制定细胞标准，开发评估方法，并开发用于再生医学的高效治疗细胞的细胞培养技术。
已出版的杂志：小方法
论文标题：基于液滴的聚糖和 RNA 测序用于分析单细胞中不同的细胞糖状态
作者：Sunanda Keisham、Sayoko Saito、Satori Kowashi、Hiroaki Tateno
DOI：https://doiorg/101002/smtd202301338
发明名称：“糖链分析方法”
国际申请号：PCT/JP2021/010385
申请日期：2021 年 3 月 15 日