国立先进产业技术研究所 [主席：石村和彦]（以下简称“AIST”）细胞和分子工程研究部[研究主任：Reki Miyazaki] 多细胞系统控制研究小组 Hiroaki Tateno，研究组组长，Aya Minoshima，技术人员（研究时），Haruki Kodaka，研究员：筑波大学，国立大学株式会社[社长：永田][恭介]（以下简称“筑波大学”）医学部生命科学系生物信息学系与尾崎亮副教授合作，一个细胞聚糖和基因（提取特征）。
DNA 条形码凝集素)，我们开发了一种技术，可以使用下一代测序仪（DNA解码装置）同时分析每个细胞的糖链（细胞标记）和指示细胞特征的基因。这项技术预计将有助于各种生物医学研究，包括开发针对引起疾病的稀有细胞的治疗药物以及再生医学中使用的细胞的质量控制。该技术的详细内容将于2021年7月16日发表在国际学术期刊《i科学
获取单个细胞的糖链和基因信息
聚糖是由多种单糖（例如葡萄糖）组成的化合物，覆盖在细胞表面。根据单糖的类型及其连接，糖链有多种类型，并且它们包含最多样化和最复杂的细胞信息。糖链的形状根据细胞的类型和性质（分化、癌变等）而发生很大变化，因此它们作为细胞标记物越来越多地应用于各种疾病的诊断和治疗、再生医学中使用的细胞的质量控制等。
近年来，综合分析单个细胞中表达的基因等信息的技术得到发展，并广泛应用于癌症、免疫、神经和干细胞等研究领域。然而，到目前为止，有关糖链的信息只能在细胞群的基础上获得，并且无法分析单个细胞表面的糖链。因此，目前还无法获得癌症干细胞（肿瘤组织中存在的稀有细胞）和循环肿瘤细胞（血液中少量存在）的糖链信息。
AIST 一直在从多种凝集素的反应模式中提取糖链的特征聚糖分析的技术将数十种凝集素置于载玻片上凝集素微阵列可以对生物样品中的糖链谱进行批量分析。迄今为止，我们已经利用凝集素微阵列发现了包括干细胞和癌细胞在内的各种细胞中糖链的特征，并着手开发各种干细胞质量控制技术和癌症候选药物。然而，存在无法获得构成细胞群的单个细胞的聚糖信息的问题。
这项研究和开发得到了日本科学技术振兴机构的“研究成果优化扩展支持计划（A-STEP）产学合作（护理型）”和“战略创意研究促进项目（PRESTO）集成单细胞分析创新技术平台（2016-2019）”的支持。
为了分析细胞中存在的极少量的糖链，需要对糖链信息进行放大和分析。因此，我们认为，通过修改与单个凝集素相对应的短碱基序列标记（DNA条形码），使用聚合酶链式反应（PCR）扩增与细胞结合的凝集素的DNA条形码，并使用下一代测序仪分析DNA条形码的数量，可以获得细胞的糖链谱。
我们选择了 39 种与生物世界中存在的各种糖链发生反应的凝集素，并构建了一个库，其中每种凝集素都引入了独特的 DNA 条形码（图 1A）。接下来，使带有DNA条形码标记的凝集素文库与细胞群反应，并使用毛细管（如头发丝一样细的管子）分离每个细胞。然后通过光照射将DNA条形码与每个凝集素分离，并经过PCR扩增后，使用下一代测序仪间接测量与单个细胞结合的凝集素分子的类型和数量，以获得单个细胞的糖链谱。这个方法scGlycan-seq（s单个c呃g狼人seq影响）。此外，从剩余的单细胞中提取RNA以及现有的单细胞基因表达分析方法scRNA 测序（s单个c呃RNA 序列Uencing) 用于同时分析单细胞中表达的糖链和基因的技术scGR-seq（s单个c呃g狼人和R不适用sequencing）被开发出来（图1B）。
图1 DNA条形码标记的凝集素(A)和单细胞碳水化合物RNA同步分析技术(scGR-seq方法)(B)概述
此前，AIST 已成功开发出一种与 iPS 细胞发生特异性反应的凝集素。因此，我们首先通过测量荧光量来测量荧光标记的iPS细胞特异性凝集素对iPS细胞和成纤维细胞的反应性流式细胞术进行分析结果，iPS细胞特异性凝集素与iPS细胞结合并表现出高荧光强度（图2A，红线）。另一方面，它不与成纤维细胞反应，也没有检测到荧光（图2A，蓝线）。接下来，使用 scGlycan-seq 方法，我们逐个细胞检查了标记有 DNA 条形码的 iPS 细胞特异性凝集素与 iPS 细胞和成纤维细胞的反应性。 iPS 细胞特异性凝集素对 iPS 细胞表现出高反应性，与流式细胞术结果相似（图 2B，红色）。另一方面，未显示出对成纤维细胞的反应性（图2B，蓝色）。因此，可以看出，使用 scGlycan-seq 方法得到与标准方法相同的结果。更远主成分分析的统计分析方法时为了对 39 种凝集素的每个细胞的响应数据进行分类，通过细胞类型（iPS 细胞和成纤维细胞）清楚地识别了单个细胞（图 2C，水平轴）。此外，我们发现即使在相同的细胞类型中，各个细胞的聚糖谱也存在差异（图 2C，纵轴）。另一方面，通过大量数据，虽然我们能够确认细胞类型之间糖链的差异，但我们无法确定每个细胞糖链的差异（图2C）。换句话说，通过使用scGlycan-seq方法，我们能够分析每个细胞中糖链的差异。
图 2 通过主成分分析比较 iPS 细胞特异性凝集素反应性和细胞分类
A：通过流式细胞术检测 iPS 细胞特异性凝集素对成纤维细胞和 iPS 细胞的反应性。
B：通过 scGlycan-seq 方法测定 iPS 细胞特异性凝集素对成纤维细胞和 iPS 细胞的反应性。
C：使用主成分分析根据对 39 种凝集素的反应性对细胞进行分类。
接下来，我们使用 scGR-seq 分析了人类 iPS 细胞和人类 iPS 细胞衍生的神经祖细胞，该方法可同时分析单个细胞中的糖链和基因表达。获取数据UMAP的统计分析方法对其进行分析。 （统一流形近似和降维投影）。因此，仅使用一种类型的细胞信息（基因表达或糖链）不可能完全区分两种细胞类型（人类 iPS 细胞和神经祖细胞）（图 3A 和 B）。另一方面，通过使用糖链和基因表达的细胞信息，我们能够准确地区分两种细胞类型（图3C）。
图3 iPS细胞和iPS细胞来源的神经祖细胞的分类
基于 RNA (A)、糖链 (B) 以及 RNA 和糖链综合数据 (C) 的细胞分类。
UMAP_1、UMAP_2：每个数据集的主成分压缩为二维时的正交成分。
最后，我们对人类 iPS 细胞和人类 iPS 细胞衍生的神经祖细胞中表达的糖链和基因之间进行了相关性分析。结果，人 iPS 细胞特异性凝集素的反应性为多能性标记基因（POU5F1)的表达表现出最高的相关性。此外，我们还发现了一种新的候选聚糖标记，它与一组参与神经祖细胞分化的基因相关。研究发现，通过使用 scGR-seq 方法，可以获得组成细胞群的单个细胞的基因和糖链信息。
我们将继续将新开发的单细胞聚糖分析技术（scGlycan-seq、scGR-seq）作为研究试剂盒进行实际应用。此外，通过使用已开发的技术来分析构成个体和器官的单个细胞的糖链，我们将阐明糖链在器官形成和癌症微环境中以前未知的作用。此外，通过对肿瘤组织、类器官、循环肿瘤细胞、人iPS细胞衍生的分化细胞等进行分析，我们将开发新的医药产品和再生医学细胞的精确质量控制技术。