国立先进产业技术研究所 [主席：Ryoji Chubachi]（以下简称“AIST”）生物医学研究部[研究主任：Katsuhiro Omiya] 分子和细胞育种研究小组研究员 Yukako Chiga，合作研究员 Hiroshi Imamura（现任立命馆大学生命科学学院助理教授），结构生理学研究小组 Toshihiko Ogura 由同一部门的高级首席研究员兼副研究主任 Shinya Honda 在 AIST 开发。扫描电子介电显微镜 (SE-ADM)各种尺寸和形状抗体的聚合可以在水溶液中观察到。此外，根据对 SE-ADM 获得的图像的分析，抗体聚集体分形,分形维数的计算有望阐明聚集体的形成机制。
8788_8923分辨率无需进行干燥或染色等预处理即可直接测量。来自蛋白质科学领域的基础研究，抗体药物的开发和制造
此成就的详细信息将于 2019 年 3 月 19 日（美国东部标准时间）公布分析化学（在线版）。
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| 水溶液中抗体聚集体的观察和图像分析 |
广泛用于治疗癌症和自身免疫性疾病生物制药的质量控制需要聚集体分析技术。其中，抗体药物往往被制成高浓度的蛋白质溶液，在生产、储存、运输等过程中受到各种物理和化学应力，使其容易发生聚集。特别是在纯化过程和病毒灭活过程中，必须使抗体溶液呈酸性一定时间，然后中和（pH变换操作），但众所周知，中和时会产生聚集体并逐渐生长。聚集体不仅会在给药过程中引起问题并降低功效，而且还会免疫原性的增加可能会诱发患者的免疫反应，导致不良事件。聚集体与免疫原性之间的因果关系发表于 2014 年FDA 指南同时也敲响了警钟，对聚集体进行适当的评估和管理对于开发和制造具有保证功效和安全性的抗体药物至关重要。
蛋白质（包括抗体）的聚集体的大小和形状会根据压力因素而变化。然而，目前还没有一种方法可以评估在溶液条件下生成的所有尺寸的聚集体，并且根据尺寸选择分析方法（图1）。然而，这一直是一个问题，因为可能无法简单地比较具有不同测量原理的分析方法之间的结果。另外，扫描电子显微镜 (SEM)可以观察从几十纳米到几毫米的大范围样品尺寸，需要将样品置于真空中，并且存在对样品干燥、染色等预处理以及电子束照射对样品的影响的担忧。
基于这一背景，人们希望有一种分析技术，能够观察水溶液中蛋白质等蛋白质聚集体的原始状态和各种尺寸，从聚集初始阶段的微小聚集体到成熟聚集体。
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图 1 适用于各种分析方法的粒径
主要有在溶液条件下测量的分析方法（红色）和在真空条件下测量的分析方法（蓝色）。 |
在AIST，为了为生物制药行业做出贡献，我们一直在通过pH值变化阐明人单克隆抗体的聚集机制，并开发检测和去除聚集体的技术。我们还利用新方法和新想法推动研究和开发，以加深我们对抗体聚集机制的理解。此外，我们一直在开发可用于生命科学领域的显微镜相关技术。这次，我们决定使用AIST之前开发的SE-ADM（图1）来观察抗体等蛋白质聚集体的生长过程。
请注意，本次研发的一部分是作为下一代生物制药制造技术研究协会的一项活动进行的，该协会在国家研究开发机构日本医学研究开发机构 (AMED) 的支持下参与了一项名为“开发基础药物发现技术以实现下一代治疗和诊断（符合国际标准的下一代抗体药物等的制造技术）”的委托项目。 (JP17ae0101003)。这项研究和开发的一部分还得到了日本学术振兴会 (JSPS) 科学研究补助金 (JP15H04365 和 JP17H05829) 的支持。
SE-ADM 由 AIST 于 2014 年开发，使用使用超薄膜技术制造的样品盘，该技术在半导体应用中拥有良好的记录，并连接到 SEM。 SE-ADM不需要传统SEM中必需的样品脱水和干燥等预处理，因此可以避免样品因干燥而变形。此外，由于电子束不直接照射样品，因此电子束对样品的损伤较小。此外，其分辨率比通常用于观察溶液中生物样品的光学显微镜更高，甚至可以在高倍率下观察光学显微镜无法看到详细结构的样品。
通过使用 SE-ADM，我们首次能够按原样观察水溶液中的纳米级人单克隆抗体聚集体（图 2，左）。在施加酸胁迫并将 pH 值恢复到中性条件的 pH 值变换操作后，使用 SE-ADM 对样品进行拍照，获得的图像显示存在各种尺寸和形态的聚集体。另一方面，为了进行比较，当我们使用 SEM 观察经过相同 pH 变化操作的样品时，我们观察到的图像似乎是由于干燥和染色等预处理而导致聚集体积累造成的（图 2，右）。
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| 图2 通过该方法(SE-ADM)和常规方法(SEM)获得的抗体聚集体的图像 |
接下来，使用 SE-ADM 对 pH 变换操作后的样品进行长达 3 周的观察（图 3）。老化1天的样品中，20～70nm的粒子占大部分，但1周后，粒径变为数百～数千nm，3周后，成为数十微米以上的聚集体。到目前为止，需要根据样本量使用不同的分析方法和分析仪来分析抗体聚集体。此外，不同设备之间的样品分析条件和测量原理不同，因此很难简单地比较设备之间的数据。相比之下，通过使用SE-ADM，我们能够证明使用相同的分析条件和分析仪可以全面观察聚集体的逐渐生长过程以及聚集体从数十纳米到几微米的宽尺寸分布。此外，根据拍摄的图像数据进行尺寸测量的可靠性很高，并且可以以小于±20%的精度、小于±10%的精度和小于50nm的量化下限对微观结构进行量化。
也被药品制造商用作质量分析方法尺寸排阻色谱 (SEC)是啊静态/动态光散射 (SLS/DLS)只能获得聚集体的尺寸信息，但如果使用SE-ADM，还可以分析形态信息。使用 SE-ADM 拍摄的图像显示，抗体聚集体的表面具有类似于海岸线图的形状，但详细的图像分析表明该形状具有分形特性。此前，我们使用SLS和DLS确认了抗体在pH变化操作后24小时内表现出分形聚集体生长，但这次我们能够证明，在24小时后生长到100 nm或更大尺寸的聚集体也表现出分形特性，而这很难用SLS或DLS测量。
还显示分形维数约为 175。在基础物理学中，已知聚集体的形成机制与所得聚集体的分形维数之间存在一定的关系。目前的结果表明，25°C 下抗体的聚集是一种以颗粒扩散为主的反应。此外，由于结果与从 SLS 和 DLS 获得的分形维数数据基本一致，因此认为抗体聚集体可能通过单一机制形成和生长，尺寸从几纳米到几微米。
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图 3 人单克隆抗体聚集体的时间依赖性观察
通过 pH 变换操作制备样品。从左边开始，观察到 pH 变化后在 25°C 下储存 1 天、1 周和 3 周的聚集体。 |
这一次，SE-ADM 已被证明可用于分析尺寸范围从数十纳米到数百微米的聚集体的形态和尺寸分布。此外，由于可以通过分析捕获的图像来计算分形维数，因此认为它对于阐明聚集体的形成机制是有效的。未来，通过重现实际药物储存环境，利用SE-ADM在实际储存温度和储存期限下长期观察抗体聚集体的发育和生长过程，或许有助于阐明聚集机制，预计这将对抗体药物聚集体发生的预测和抑制技术的发展产生连锁反应。此外，这种从SE-ADM图像分析分形维数和大小的方法不仅可以应用于抗体，还可以应用于其他蛋白质的聚集，因此有望为蛋白质科学领域的基础研究做出贡献。
我们将继续使用 SE-ADM 对各种抗体聚集体进行液体观察。此外，我们的目标是通过在各种条件下产生聚集体并研究抗体聚集体受到的物理和化学应力与聚集体的尺寸和形状之间的关系来积累基础知识。通过这一点，我们将致力于阐明抗体聚集的机制。