国立先进产业技术研究所[理事长：中钵良二]（以下简称“AIST”）生物过程研究部[研究主任：田村智博]研究组组长宫崎健太郎与北海道大学[校长：名和丰治]、理科研究生院、项目助理教授北原圭等人合作研究环境问题细菌16S 核糖体 RNA (16S rRNA)在基因库中，我们发现了多个对奇霉素（一种用于治疗淋球菌感染的抗生素）具有抗药性的 16S rRNA 基因。此外，抗性基因突变分析结果，新抗性突变
rRNA是抗生素的主要靶点之一，当rRNA发生耐药突变时，抗生素就会失效。因此，关于耐药突变的信息对于耐药细菌的早期检测是有用的，但到目前为止，识别rRNA中的耐药突变一直很困难，并且关于耐药突变的信息还没有充分积累。这次，发现AIST的专有技术可以对来自以大肠杆菌为宿主的外来细菌的16S rRNA进行功能分析，以验证抗生素耐药性。利用该技术，我们从环境中细菌来源的16S rRNA基因中鉴定出了四种耐药基因，并通过对这些基因的突变分析，发现了三种新的壮观霉素耐药突变。通过将该方法应用于各种抗生素耐药突变的验证，有望构建耐药突变数据库，有助于耐药细菌的发现和诊断。
这项研究的详细信息可以在2018年4月3日（英国时间）的《英国科学杂志》上找到科学报告
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| 利用16S rRNA功能分析技术的抗生素耐药性筛选摘要 |
抗生素具有杀死病原菌的作用，因此正在开发抗生素来抑制传染病。然而，在许多情况下，病原菌与其他生物体一样，具有逃避抗生素攻击并获得抗生素耐药性的机制。有关耐药突变的信息对于耐药细菌的早期检测和诊断非常重要，但尚未积累足够的知识。造成这种情况的原因之一是，许多抗生素的靶标 rRNA 的功能分析方法尚未建立。由于 rRNA 是生物体中产生最丰富的重要基因，因此许多细菌的基因组中都有多个拷贝。因此，即使在单个细菌内，获得抗性的基因和未获得抗性的基因也可能共存。当多拷贝中只有部分基因获得抗性时，一般不会表现出强抗性，抗性突变仍处于“潜伏”状态。为了可靠地检测这些潜在的耐药性突变，需要对整个基因组中包含的多种rRNA单独分析是否存在抗生素耐药性，但迄今为止还没有分析方法，需要开发一种分析方法。
迄今为止在 AIST，核糖体的功能分析方法之一，我们开发了一种在物种之间交换16S rRNA的遗传方法，翻译他为核糖体的功能分析带来了创新，包括发现核糖体这种装置中翻译以外的功能（RNA 降解酶抑制活性）。2011 年 11 月 23 日 AIST 新闻稿）。另外，大肠杆菌在进化系统发育分类中被称为“绳子”甚至更高“门2012 年 10 月 30 日、2017 年 8 月 30 日 AIST 新闻稿）。
这次，我们利用这种在物种之间交换 16S rRNA 的方法，从环境中各种细菌来源的 16S rRNA 中筛选出对壮观霉素（一种作用于 16S rRNA 的抗生素）具有抗性的 16S rRNA 基因，并通过对发现的抗性 16S rRNA 基因进行突变分析来鉴定新的抗性突变。
这项研究得到了日本学术振兴会科学研究资助金、挑战性探索性研究“核糖体 RNA 抗生素耐药性突变的综合分析”（2014-2017 年）的支持。
16S rRNA基因是生长所必需的基因，缺乏该基因的大肠杆菌就无法生长。此外，16S rRNA基因是物种特异性基因，人们一直认为物种之间不存在功能相容性。然而，2012年，AIST发现大肠杆菌16S rRNA基因缺陷菌株并检查它是否可以增长 (增长互补性别筛选），我们发现大肠杆菌 16S rRNA 基因缺陷菌株可以利用源自许多不同类型细菌的 16S rRNA 进行生长。
所以，为了用这种方法筛选环境中细菌的16S rRNA是否存在抗生素耐药性，我们首先从能够生长大肠杆菌16S rRNA基因缺陷菌株的环境细菌中获取了大量的16S rRNA基因，并创建了一个由数万个大肠杆菌突变菌株组成的文库。接下来，为了获得对壮观霉素具有抗性的16S rRNA基因，将该大肠杆菌突变体文库在含有壮观霉素的培养基中培养，分离出能够生长的大肠杆菌突变体，即具有抗性的大肠杆菌突变体。通过分析这些16S rRNA基因，我们鉴定了四种类型的壮观霉素抗性16S rRNA基因（图1）。
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| 图1抗生素耐药性筛查流程 |
我们对这四个物种的壮观霉素抗性16S rRNA基因进行了测序，并在美国国家生物技术信息中心（NCBI）的基因序列数据库中检索了与抗性16S rRNA基因相似的基因。在数据库中同源基因不认为对奇霉素具有抗性，可以通过比较抗性基因和数据库中的基因的序列来估计抗性基因中的抗性突变（图2）。例如，环境来源的壮观霉素抗性基因之一mgSpc2中，第1066个碱基是T，而在NCBI基因序列数据库中发现的同源基因（图2中表示为mgSpc2hom）中，它是C。在这种情况下，可以假设抗性是通过将第1066位碱基C替换为T而产生的。
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图2 16S rRNA基因碱基序列比较（部分区域）
（顶行）显示壮观霉素抗性的四个 16S rRNA 基因之一
（中行）从NCBI基因序列数据库中检索到的同源基因
（下排）大肠杆菌的16S rRNA基因 |
为了验证这种耐药突变的估计是否正确，我们分析了源自环境中细菌的壮观霉素耐药 16S rRNA 基因中的耐药突变。定点诱变方法转换为同源基因中包含的碱基类型（在图2的例子中，mgSpc2的第1066个T转换为C），并研究大肠杆菌突变株是否会失去抗性。此外，将推定的耐药突变整合到非壮观霉素耐药大肠杆菌的 16S rRNA 基因中，以确定是否会产生耐药性。这些验证的结果是，除了五个已知的耐药突变之外，还发现了三个新突变（图 3）。
壮观霉素是50多年前开发出来的一种作用于细菌核糖体的抗生素，具有悠久的临床应用历史，对其耐药机制和耐药突变进行了大量研究。尽管已经积累了大量关于壮观霉素的知识，但新的耐药突变的鉴定表明，环境中隐藏着许多未知的耐药突变。
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| 图3 大肠杆菌16S rRNA的二级结构 壮观霉素抗性突变集中区域的放大图。已知的抗性突变以白底黑色数字显示，新发现的抗性突变以黑底白色数字显示。
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迄今为止，还没有有效的方法可以单独检查细菌中的多个 rRNA 来识别抗生素耐药细菌，但 AIST 以大肠杆菌为宿主分析 16S rRNA 功能的独特方法表明，通过检查单个 16S rRNA 的功能可以识别抗生素耐药细菌。此外，该方法还可应用于奇霉素以外的抗生素。因此，未来如果我们利用这种方法来筛选各种抗生素的耐药性并积累耐药突变的数据，就有可能构建抗生素耐药突变的数据库，从而有助于耐药菌的早期检测和诊断。
未来，我们将扩大筛选范围，包括攻击16S rRNA的其他抗生素，甚至包括攻击23S rRNA的抗生素。通过这样做，我们的目标是建立一个基于rRNA突变的抗生素耐药性突变综合数据库，并建立快速、准确地确定特定抗生素是否对病原菌有效的技术。