国立先进产业技术研究所（主席：石村和彦）（以下简称“AIST”）、细胞和分子工程研究部、动态药物发现模态研究组、竹内恒、研究组组长、德永雄二、东京大学研究组组长（主席：五上诚）、中外制药株式会社（董事长兼代表）导演：小坂达郎）抗体的高阶结构（HOS）我们开发了独特的NMR测量技术，可以在配方条件和低温储存温度下无损地获取信息。
生物制药的进步，需要基于HOS评估其有效性和安全性。然而，尚未建立不受溶液成分或测量温度限制的非破坏性获取诸如抗体等高分子量生物药品的HOS信息的技术。新开发的氮核观测CRINEPT方法（N-CRINEPT方法）是基于AIST的核磁共振我们进一步改进了测量技术，并引入了全新的实验方案，可最大限度地提高高分子量条件下 NMR 信号生成的效率。这使得居屋信息的灵敏度、全面性和完全无损性显着提高。新开发的技术使得获得抗体分子在制剂储存条件下的HOS信息成为可能，有望为抗体药物的研发做出贡献。此外，通过使用这种方法，可以显着增加可通过 NMR 分析的蛋白质数量。
该技术的详细信息将于 2020 年 5 月 6 日（美国东部夏令时间）发布药物化学杂志（doi：101021/acsjmedchem0c00231）。
N-CRINEPT 方法可以完全无损地观察生物制药中的 HOS
抗体结构中的蓝色和红色圆圈表示可观察到的氨基酸的位置。
近年来，以抗体为代表的生物制药份额不断扩大。为了使生物制药有效，其主要成分（例如抗体蛋白）必须在溶液中呈现适当的高阶结构（HOS）。另一方面，抗体蛋白中的HOS很容易因热等因素而降解。抗体蛋白的劣化不仅会降低抗体药物的疗效，还会增加副作用，因此获取HOS信息对于确保安全极为重要（图1）。然而，使用传统的分析技术，存在测量本身可能影响HOS的风险，即使使用能够在溶液条件下无损获取蛋白质HOS信息的NMR方法，也无法在配方条件下的低储存温度下进行完全无损的HOS分析。
图1抗体药物的降解和HOS分析的重要性
AIST 一直在进行研究，目标是开发一种完全无损且全面的 HOS 分析技术，该技术利用 NMR 方法并在低温储存温度下保持配方条件。作为其中的一部分，我们于 2019 年开发了它FC-TROSY 方法，首次可以对分子量为150,000或以上的抗体进行实用的非破坏性观察（AIST 新闻稿 2019 年 3 月 12 日）。然而，由于能够观察到的位点仅限于芳香族氨基酸，因此无法实现完全无损的特性，并且虽然通常认为由于引入氟核而导致的蛋白质HOS的变化可以忽略不计，但HOS发生变化的可能性并非为零（图2左）。因此，我们致力于开发一种技术，使我们能够完全无损地观察居屋。
请注意，本开发是由日本医学研究开发机构（国家研究开发机构）“实现下一代治疗和诊断的药物发现基础技术开发项目”委托的项目，也是日本学术振兴会（独立行政机构）的资助项目。这项工作得到了探索性研究（项目编号：18K19415，2018-2019）和基础研究（C）（项目编号：19K07040，2019-2021）的支持。
新开发的N-CRINEPT方法（正式名称是15N 检测到的互相关弛豫和通过偏振转移、氮 15 直接观察增强的不敏感核交叉松弛低灵敏度原子核的灵敏度增强方法）为了能够进行NMR观察，需要用稳定同位素标记酰胺部分，以增加氮15的比例，氮15是一种稳定同位素，在自然界中以01%存在。然而，它不需要引入FC-TROSY方法中所需的氟等不同元素，并且不存在改变HOS的风险，使其完全无损。此外，通过开发和引入全新的NMR实验方案，最大限度地缩短从实验开始到测量的时间，并最大限度地提高高分子量条件下产生酰胺NMR信号的效率，不仅可以获得芳香族氨基酸的信号，还可以获得除脯氨酸之外的所有氨基酸残基的信号（图2，右）。这大大提高了获取居屋信息的全面性。
当N-CRINEPT方法应用于与用作药物的抗体具有99%或以上氨基酸序列同源性的抗体分子时，多个配方组成在存储温度处的 NMR 信号观察到（图 3）。此外，N-CRINEPT方法可以检测由于配方条件差异导致的HOS变化，糖基化（详情请参阅论文）。基于这些事实，如果这次开发的N-CRINEPT方法被证明是有效的，那么它不仅有望用于稳定同位素标记已经广泛使用的开发阶段，而且还可以用于生物制药的生产、配方、运输和储存等多种情况（图4）。迄今为止，分子量超过150,000的蛋白质的NMR分析需要氘化，其中蛋白质中的氢原子被氘原子取代。然而，许多大膜蛋白，例如新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的表面蛋白，无法使用常规NMR技术进行分析，因为它们只能在哺乳动物细胞中表达并且难以氘化。 N-CRINEPT方法可用于这些大膜蛋白的HOS分析，因此具有广泛的应用范围。
图2 N-CRINEPT方法，允许完全无损观察
图3 不同制剂组合物中抗体的N-CRINEPT谱
一个信号对应一个氨基酸残基。尽管预计会出现 31 个信号，但在两种处方条件下均观察到了超过 70% 的信号。两种模式的相似性表明它们的高阶结构几乎相同。
图4 预计使用N-CRINEPT方法的各种情况
未来我们将继续N-CRINEPT方法的社会落地，例如将其应用于研发阶段的抗体药物。此外，我们将进一步发展利用核磁共振方法的基础药物发现支持技术，建立一个不仅可以处理生物制药而且可以处理小分子和中分子等多种药物的基础药物发现技术平台。
国立产业技术综合研究所
细胞与分子工程研究部动态药物发现模式研究组
研究员 Yuji Tokunaga 电子邮件：tokunagay*aistgojp（发送前请将 * 更改为 @。）
细胞与分子工程研究部动态药物发现模式研究组
研究小组负责人 Hisashi Takeuchi 电子邮件：koh-takeuchi*aistgojp（发送前请将 * 更改为 @。）