国立先进产业科学技术研究所[主席Ryoji Chubachi]（以下简称“AIST”）药物发现分子分析研究中心[研究中心主任Toru Natsume]结构模态研究组研究组组长竹内恒和哈佛医学院丹娜法伯癌症研究所哈里·阿塔纳里博士。核磁共振的观察灵敏度，比检测分子量超过100,000的大蛋白的常规方法大一个数量级芳香族氨基酸成功对残基侧链进行核磁共振观察。
生物制药的质量高阶结构处于溶液状态。 NMR方法可以直接在溶液中分析生物聚合物的高阶结构，近年来有望作为一种分析技术应用于生物药品的开发和质量评价。然而，存在灵敏度随着分子量增加而降低的问题。特别是，对于大量存在于生物药物的功能位点并负责与靶标结合的芳香族氨基酸残基的侧链，NMR观察的极限是30,000左右的分子量，而对于分子量超过100,000的抗体等生物药物，NMR观察是困难的。
此次开发的NMR方法可以通过在分子量180,000的芳香族氨基酸的侧链上引入氟来进行NMR观察，以及抗体（分子量150,000）等高分子量生物药品的高阶结构分析和评价。它还为药物发现研究和开发开辟了多种可能性，包括抑制剂和激活剂的开发以及高功能药物的开发。该技术的详细信息于2019年3月11日（英国时间）发表在英国科学杂志上。自然方法发表在杂志上。
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| 高分子生物药物的分子量和可进行NMR观察的范围 |
生物制药是现代医学不可或缺的一部分，对于小分子药物无效的靶点表现出高度特异性的功效。由于许多生物药物的活性成分是蛋白质等生物聚合物，其分子尺寸较大；抗体药物是生物制药的一种，分子量最大为15万日元。另一方面，生物药物的功效和副作用因其高阶结构而有很大差异。例如，如果生物药品由于长期储存而变质，其高阶结构发生变化，则药物的功效可能会丧失或副作用可能会增加。
在生物制药的质量评价和开发中，高阶结构极其重要，因此需要能够对高阶结构进行原样分析的技术。然而，传统的高阶结构分析方法需要对生物药品进行某种修改，这并不能消除高阶结构发生变化的可能性。
此外，阐明溶液中酶的活性位点和靶分子的药物结合位点的高阶结构，可以为增强酶活性以及通过药物结合分析开发抑制剂和激活剂提供重要信息。因此，对于药物发现研究和开发，需要开发一种分析溶液中高阶结构的方法。
在AIST，我们致力于使用NMR方法的基础药物发现支持技术的开发和社会实施，我们不仅正在进行小分子药物的研究和开发，还进行生物制药等新药物的研究和开发。特别是，我们专注于直接在溶液中分析生物聚合物高阶结构的NMR方法的开发和应用，最近我们与哈佛医学院的Dana-Farber癌症研究所合作开发了一种新方法，可以对分子量超过15万日元的抗体等蛋白质的芳香族氨基酸侧链进行NMR观察。
NMR具有能够在原子水平上分析溶液中生物聚合物天然高阶结构的优异特性，有望应用于生物药物高阶结构的评价。然而，对于在与靶标相互作用位点处大量存在的芳香族氨基酸残基侧链，当分子量变高时，灵敏度特别显着降低，而传统方法的分子量约为30,000，这是观察的极限。因此，利用NMR方法来分析和评估抗体等大分子量生物药物的功能核心部分的高阶结构一直很困难。
这次，我们开发了“FC-TROSY方法”，利用迄今为止尚未受到太多关注的氟（F）和碳（C）原子核之间的干扰，显着提高芳香族氨基酸残基侧链NMR信号的灵敏度。另外，由于测定对象的芳香族侧链原本不含有氟，因此测定预先在侧链导入了氟的样品。迄今为止，TROSY法作为利用氢原子核(H)和氮原子核(N)或氢原子核和碳原子核之间的干涉来进行高分子蛋白质的NMR观察的方法而被人们所知。 HC-TROSY方法利用氢原子核和碳原子核之间的干扰，用于检测芳香族氨基酸残基的侧链，但在高分子量区域，由于灵敏度不够，无法观察到芳香族侧链。另一方面，FC-TROSY方法利用氟和碳核之间的干扰，能够以比HC-TROSY方法高一个数量级的灵敏度测量芳香族侧链。
分子量约为 42,000 的蛋白质的芳香族氨基酸残基酪氨酸残基并使用新开发的FC-TROSY方法和传统的HC-TROSY方法进行NMR观察。结果，使用HC-TROSY方法，仅观察到3个信号，这比理论上预期的数量要少（图1，右），但使用FC-TROSY方法，观察到与酪氨酸残基数量相对应的所有强信号，证实灵敏度显着提高（图1，左）。此外，即使对于分子量大一个数量级（分子量180,000）的蛋白质，也可以使用FC-TROSY方法观察NMR信号。此外，我们观察到当该蛋白质与抑制剂结合时 NMR 信号发生变化（图 2）。
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| 图1 使用新开发的FC-TROSY方法（左）和HC-TROSY方法（右）观察到的芳香氨基酸信号 |
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| 图2 使用FC-TROSY方法观察到分子量为180,000的蛋白质（图1左） |
氟核已被引入蛋白质中并用于NMR观察，并且可以使用市售光谱仪进行测量。此外，由于引入氟核而引起的蛋白质高级结构的变化被认为可以忽略不计。预计FC-TROSY方法将能够评估抗体等高分子量生物药品的真实高阶结构。此外，该新方法可广泛应用于高分子量酶活性位点和受体配体结合位点（包括膜蛋白）的高阶结构分析。此外，由于作为新药而受到关注的核酸药物也可期待同样的灵敏度的提高，因此也期待其在高分子量核酸药物中的应用。
未来，我们将使用抗体药物和药物发现靶蛋白等实际的高分子量生物药物来开发和社会实施评估其高阶结构的技术。此外，我们计划开发利用核磁共振方法的药物发现基础支持技术，建立可处理小分子、生物制药、中分子等多种药物的药物发现基础技术平台。