实现疟疾的准确早期检测！

2017/07/31

实现疟疾的准确早期检测！使用细胞芯片开发诊断技术将挽救许多生命

❶与传统诊断方法相比，检测灵敏度高出一个数量级。
❷我们开发了一种任何人、任何地方都可以轻松操作的诊断设备。
❸在非洲恶劣环境下进行现场测试并投入实际使用。

疟疾是世界三大传染病之一，每年感染2亿人，并导致43万人死亡。为了预防疟疾感染引起的死亡和严重疾病，需要开发有效的药物以及准确、高灵敏度、快速和简单的诊断方法。然而，目前建立的诊断方法各有利弊，尚无一种方法能够满足所有要求。
AIST专注于应用细胞芯片技术的方法，这与传统的诊断方法不同，并成功开发了一种快速、简单且准确度最高的诊断技术。目前，研发工作正在继续进行，同时在非洲进行实地测试以供实际应用。

旨在开发一种既准确又易于使用的疟疾诊断方法

　片冈正敏原本是牙科领域的研究员，但当他遇到使用生物标志物的疾病诊断研究时，他被吸引并转向临床检验医学和诊断设备开发领域，于2006年加入AIST。很快，从事利用疟原虫进行囊泡运输研究的八代清树和专门从事微加工技术的山村昌平也加入了同一研究小组。

　“看来我们可以通过利用聚集在一起的研究人员的不同背景来做一些事情。”片冈决定与这个团队合作开发一种疟疾感染的诊断方法，疟疾感染仍然导致许多人死亡。当时，诊断疟疾感染的方法主要有三种，但每种方法都有优点和缺点，并且面临许多挑战。

　世界卫生组织（WHO）使用的标准诊断方法是对患者血液中的红细胞进行染色，并使用光学显微镜进行观察。然而，这种方法取决于观察者的技术水平，并且由于需要观察数以万计的红细胞而非常耗时。而且，感染早期很难识别，容易忽视感染而延误治疗。

　第二种RDT方法（快速诊断方法）是寻找疟原虫特异性蛋白质的方法。操作简单，出结果快，大约需要20分钟，但问题是误报^*1很可能会出现，并且存在误诊的风险。另一个缺点是，只能确定有无感染，无法确定感染率。

　如果出现假阳性结果，药物就会被给予不需要的人，从而导致耐药性疟疾的传播。目前的情况是，曾经有效的抗疟药物变得越来越无效，必须避免这种情况，”片冈说。

　第三种方法PCR（聚合酶链式反应）需要昂贵的专用设备和试剂，操作复杂，检测需要数小时。换句话说，迄今为止还没有一种既准确又易于使用的疟疾诊断方法。因此，片冈和他的同事们设定了开发一种诊断方法的目标，该方法可以从早期阶段准确诊断感染，并且任何人、任何地方都可以轻松操作。

如何轻松准确地计算疟原虫感染的红细胞数量？

片冈认为，除了确定有无感染之外，测量感染率也很重要。了解感染的进展不仅可以进行有效的治疗，还有助于降低出现耐药原虫的风险。

　要确定感染率，只需计数被原虫感染的细胞数量即可，但现有的诊断方法，在不计数大量红细胞的情况下很难准确确定感染细胞的数量，从而难以做出快速诊断。而且设备价格昂贵，根本谈不上实用。

Kataoka和他的同事设计了一种方法来克服这个困难，他们将许多红细胞排列在细胞芯片上的单层中，只检测被原生动物感染的红细胞，并计算感染率。

　正常的红细胞没有细胞核，但感染疟疾寄生虫的红细胞却有疟原虫的细胞核。换句话说，如果我们对寄生红细胞的疟疾寄生虫的细胞核DNA进行荧光染色，我们就可以通过计数荧光红细胞来测量疟原虫的数量。认识到这一点，就是成功的第一步。''

　然而，当细胞芯片上的红细胞分层为多层时，即使染色也难以准确计数细胞数。为了实现高精度的测量，需要确保一定数量的待测细胞并将其排列在单层中，以便于测量。该团队的想法是创建一个微型室（用于储存细胞的微型室），可以将大量红细胞排列在细胞芯片上的单层中。整个团队都充满热情，认为如果他们能做到这一点，他们就能够开发出一种创新的诊断方法。

使用细胞芯片一次性分析 270 万个红细胞

　该团队针对创建能够精确排列固定数量细胞的微室这一明确的开发目标进行了反复讨论。通过控制微室的直径和深度，可以将细胞排列为恒定数量。为了确定感染率，每个室最好含有大约 100 个红细胞。如果能确诊一种原虫，感染率为1%。在此基础上，根据目标检测灵敏度和生产的难易程度，确定了微室的直径，并确定了微室的数量为20,944个。

　下一个任务是将红细胞排列成单层。实验过程中发现，当用生理盐水轻轻冲洗腔室中积聚的红细胞时，腔室底部仅残留一层红细胞。此外，一个室中剩余的红细胞数量大约恒定在130±6。由此，一次性分析约270万个红细胞的细胞芯片的总体框架就完成了。

　该团队接下来研究了一种检测疟疾寄生虫的方法。通过与松下电器产业株式会社的共同研究，开发出了能够通过简单的操作进行检测和分析的装置。

　不仅疟疾寄生虫，血液中的白细胞也有细胞核。为了使用荧光染色对寄生虫进行计数，必须从血液中去除白细胞。通常，这是使用离心机完成的，但经常会出现停电的情况。由于这些地区没有电力，我们决定使用纳米纤维作为吸附剂。我们还寻找一种低成本的荧光检测方法，并采用了CCD摄像系统。

　研究开始两年后，就可以在200万个红细胞中检测出感染一种疟疾寄生虫的红细胞，创造了一种世界一流的疟疾诊断方法，具有超高检测灵敏度，比现有诊断方法高出几个数量级。凭借这种检测灵敏度，可以在症状出现之前检测到感染。此外，检测可以在15分钟的短时间内完成，这比现有方法中最快的RDT方法更快。这样，一项能够快速、灵敏地诊断疟疾的技术就完成了。

　“但之后发生的事情很困难，”片冈苦笑着说道。

实验装置完成，将接受严酷的现场测试

　当我们在论文中发表这一结果时，一位外部专家评论说“在疟疾流行地区进行现场测试是必要的”。即使在实验室中能够实现高精度检测，在疟疾流行地区的恶劣环境中也不一定能产生类似的数字，这意味着除非能够在当地使用，否则就没有意义。

片冈和他的同事们争先恐后地寻找当地的合作伙伴组织。在大阪大学微生物疾病研究所堀井敏博教授的配合下，非洲乌干达第二大城市古卢的核心医院现将作为研究基地。然而，Guru将完成的诊断设备带到实验室的环境在日本是难以想象的。

　从乌干达首都坎帕拉到医院，路况崎岖，需要7个小时的车程，运输精密设备的环境十分恶劣。即使使用不易受振动影响的弹药运输箱，当我们到达医院时，设备还是坏了。停电是常事，即使关上窗户，房间里也布满灰尘。连我在城里买来分析的矿泉水都无法使用。”除了这些恶劣的条件外，许多非洲村庄还缺乏医生和护士。

　在日本，“卫生工作者”负责管理当地人的健康，但操作复杂的医疗设备很困难，因此我们需要简化设备，让任何人、任何地方都可以通过按一下按钮来操作并进行分析。”

　包括松下研究人员和新加入研究小组的桥本宗明在内的开发团队对这种困境感到困惑，但他们都没有放弃的意思。该团队每年多次前往非洲分析患者样本，并将现场发现带回日本进行改进。一旦完成，这项技术肯定会对很多人有用。整个团队仍然致力于以某种方式在乌干达建立这项技术并将其传播到世界各地的愿望。

　大多数疟疾受害者是非洲儿童。贫困与传染病密切相关，这是当地社区遭受苦难的原因之一。如果我们能够利用我们的技术来减少疟疾感染引起的死亡和疾病的严重程度，我们也许能够打破这个链条。我们的技术还可以为非洲社会和其他遭受疟疾困扰的地区做出贡献。”

目前，片冈和他的同事们的目标是在三年内实现疟疾分析设备的商业化和普及，并正在进行改进以使其更易于在现场使用，例如加强防尘措施和开发不会错误检测垃圾的分析方法，以及继续努力获得世界卫生组织的建议。

有望早期发现循环癌转移和复发

　此外，该技术可以准确地发现从原发肿瘤侵入血管并转移到远处器官的循环癌细胞，其临床应用值得期待。如果能够准确检测导致癌症转移的循环癌细胞，就有可能预测未来的癌症转移，从而可以在早期阶段开始治疗，例如给予适当的抗癌药物。

此外，癌症干细胞在癌症组织中数量极少，控制着增殖和转移，也引起了人们的关注。目前，抗癌药物等治疗的有效性通常通过癌组织大小的变化来评估，但即使组织暂时缩小，它也常常会再次生长或转移到远处的器官。人们希望通过对癌症干细胞（可以说是癌症的本质）的检测以及耐药性等特性的检查，为每种癌症选择最合适的治疗方法。

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