mile米乐官方网站 开发一种可以产生大量功能性蛋白质的植物

米乐m6官方网站（以下简称“AIST”）生物制造研究中心首席研究员松尾幸树RNA沉默机制，我们创造了一种具有高能力生产功能性蛋白质，同时还能正常生长和产生种子的植物。

通过将遗传信息引入生物体而产生的功能蛋白被广泛用作疫苗抗原和酶。功能性蛋白质主要利用动物细胞和微生物来生产，但近年来，利用植物的生产方法因其在安全性和生产成本方面的优越性而受到关注。然而，为了保护自己免受病毒等外敌的侵害，植物有一种被称为“RNA沉默机制”的机制，抑制外源基因的表达，而这种机制带来了降低所需功能蛋白生产效率的问题。为此，AIST 一直在研究 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 6 (rdr6基因) 已损坏rdr6我已经开发出了植物体。rdr6植物具有很高的功能性蛋白质生产能力。另一方面，rdr6Compared to the “wild type,” the plants could not grow as large and did not form seeds

这次，它与RDR6密切相关，并参与植物形态发生TAS3，TAS3的反向重复序列rdr6我们已经进行了基因改造以引入植物中。结果，我们成功地培育出了“TAS3i植物”，它不仅具有高功能性蛋白质生产能力，而且具有生长到与野生型植物相同大小并产生种子的实用性。这种植物可以高效、实用地生产功能性蛋白质。例如，在再生医学和培养肉行业中，细胞培养需要大量昂贵的功能蛋白，供应它们的成本是一个问题。利用这种植物体生产和供应功能性蛋白质预计将显着降低细胞培养的成本。此外，预计还将为制造药品、研究试剂、诊断试剂等的工业领域的成本降低和稳定供应做出贡献。该技术的详细信息将于2025年7月18日公布。植物杂志

重组蛋白是通过人工将所需基因导入生物体而在生物体细胞内合成的蛋白质。疫苗抗原和酶等功能蛋白被广泛用作药物和试剂。功能性蛋白质一般是通过将提供所需蛋白质蓝图的基因导入动物细胞或微生物中并培养来生产，但大规模生产需要较高的设备成本，并且还存在被病原体和病毒污染的风险。近年来，与使用动物细胞的传统方法相比，通过将基因导入植物中来在植物内生产功能性蛋白质的技术预计在安全性和生产成本方面具有优越性。另一方面，利用植物生产功能性蛋白仍存在表达水平低、纯化困难等技术问题，目前正在开发技术以进一步提高生产效率。

植物有一种称为“RNA沉默机制”的机制，可以保护自己免受病毒等外敌的侵害。 RNA沉默机制是一种通过降解来自外部进入的基因的信使RNA（mRNA）来防止病毒和其他生物体增殖的机制。虽然它是植物中非常重要的防御机制之一，但由于这种功能，当将基因引入植物中制造功能性蛋白质时，源自该基因的所需功能性蛋白质的mRNA也会被降解，从而降低生产效率。

AIST is a type of tobacco most commonly used for the production of functional proteins本塞姆氏烟草在RNA沉默机制中双链RNA的合成中起核心作用rdr6基因被破坏的植物”rdr6我们过去开发过“植物体”^※110822_10935rdr6该植物的缺点是它比非转基因野生型小并且不能产生种子（不育）。这次，为了更高效稳定地生产功能蛋白，rdr6We worked on creating a new plant based on the plant that overcomes these drawbacks

这项研究和开发得到了JSPS科学研究补助金“高效材料生产植物的开发”（16K14833）和NEDO（新能源和产业技术开发组织）“开发生物基产品生产技术以加速实现碳循环/工业材料生产系统的示范/开发使用植物的高度改性蛋白质的大规模生产技术”的支持（2022 财年至 2025 财年）。

在这项研究中，我们开发了能够有效生产疫苗抗原和酶等功能性蛋白质的植物。

迄今为止由 AIST 开发rdr6虽然植物由于不太可能抑制外源基因的表达而具有较高的功能蛋白生产能力，但它们比正常野生型植物小并且不形成种子，这在实际应用时成为栽培效率和菌株维持的主要限制。如果植株较小，则需要种植许多植株或延长栽培期才能获得所需量的蛋白质，这增加了栽培成本和劳动力。此外，如果无法获得种子，即使具有优良特性的植物也无法传递给下一代，从而难以建立功能性蛋白质的稳定生产体系。

rdr6抑制植物中的RNA沉默机制rdr6基因正在被破坏。另一方面，rdr6基因是“miR390–TAS3–ARF 通路的基因调控途径中发挥着重要作用。该途径对于控制植物中叶子和花等器官的形成至关重要。ARF基因（生长素反应因子基因）'' 表达的机制（图 1）。

在此途径中，首先由称为 TAS3 的特定 DNA 序列合成单链 RNA，然后在 miR390（一种具有调节基因表达作用的小单链 RNA）识别的序列处进行切割（步骤 1），并生成源自 TAS3 序列的单链 RNA（步骤 2）。根据切割的RNA合成双链RNA（步骤3），然后ta-siRNA（反式作用小干扰RNA）ARF通过诱导基因衍生 mRNA 的降解来控制其表达（步骤 4-5）。 RDR6 是第 3 步“双链 RNA 合成”的必需酶。然而，rdr6在植物中rdr6由于基因被破坏，TAS3 序列无法生成双链 RNA。结果，rdr6“miR390–TAS3–ARF 途径”在植物中无法正常发挥作用，ARF估计是基因表达不受调控。这意味着rdr6据推测这是植物形态缺陷的原因，例如矮化和种子形成异常（图2A）。

因此，双链RNA源自TAS3序列rdr6如果它能在植物中再次产生，“miR390–TAS3–ARF途径”的功能就会恢复，ARF人们认为基因表达控制可能被标准化。因此，rdr6我们引入了一种新机制，可在植物细胞内生成源自 TAS3 序列的双链 RNA（图 2B）。具体来说，我们创建了一个载体，其中 TAS3 DNA 序列以相反方向排列，中间有间隔序列。rdr6引入植物中。通过将DNA序列以相反方向排列，单链RNA可以形成自我互补的双链RNA结构（图2B）。此外，间隔序列的使用有利于双链RNA结构的形成。通过这种方式，我们开发了一种不需要RDR6功能就能与TAS3序列形成双链RNA的植物，并将这种植物命名为“TAS3i植物”（图3）。

野生型，rdr6，在每个 TAS3i 工厂中ARF基因表达状态分析的结果，rdr6植物中多种ARF已证实基因表达增加。这是rdr6反映“miR390–TAS3–ARF 通路”在植物中未正常发挥作用。另一方面，在 TAS3i 工厂中，rdr6与植物体相比是多个ARF基因表达减少。此外，在 TAS3i 工厂中，rdr6来自TAS3序列的Ta-siRNA在植物中很少检测到，但检测到了高水平。该结果表明，TAS3序列的双链RNA在TAS3i植物中正常产生，并作为下游ta-siRNA发挥作用，证实“miR390-TAS3-ARF途径”的功能已在TAS3i植物中恢复。

如图 4 所示，TAS3i 植物的叶子大小和整体植物生长已恢复到与野生型植物几乎相同的水平。另外，rdr6虽然观察到植物花的形态异常，但 TAS3i 植物表现出与野生型相同的形态，并且能够获得种子。

野生型，rdr6，使用每种 TAS3i 植物，绿色荧光蛋白 (GFP)瞬态表达式当我们尝试16185_16246|时，我们发现在用GFP表达处理的野生型植物中，仅观察到非常弱的GFP荧光，而在用GFP表达处理的野生型植物中rdr6在植物和 TAS3i 植物中均观察到极强的 GFP 荧光（图 5）。这表明 GFP 在 TAS3i 植物中大量产生。

从上述结果来看，rdr6已经清楚的是，在植物中证实的高功能性蛋白质生产能力在TAS3i植物中得以保持。

TAS3i 植物与野生型植物一样健康生长，并且能够正常形成种子。另一方面，在 TAS3i 工厂中rdr6The gene is still in a destroyed state, so the RNA silencing mechanism is suppressed结果表明，TAS3i植物保持了高水平的功能性蛋白质生产能力，是兼具“正常形态”和“高蛋白质生产能力”这两者难以同时实现的特性的极其优良的植物（表1）。

未来，我们计划利用植物（包括TAS3i植物）建立医药和工业功能蛋白的高效生产系统，并致力于开发更通用的表达平台。我们还计划致力于阐明miR390-TAS3-ARF通路和RNA沉默的分子机制。

已出版的杂志：植物杂志
论文标题：恢复RNA 依赖性 RNA 聚合酶 6基因敲除表型本塞姆氏烟草via in vivo generation of inverted repeat construct of the trans-acting short interference RNA3 sequence
作者：松尾幸树
DOI：101111/tpj70350

※1：Matsuo, K 和 Atsumi, G CRISPR/Cas9 介导的基因敲除rdr6基因在本塞姆氏烟草用于重组蛋白的高效瞬时表达。普兰塔250, 463–473 (2019)https://doiorg/101007/s00425-019-03180-9

RNA沉默机制

它是植物用来检测从外部引入的基因（例如病毒）并抑制其影响的防御机制之一。当它识别来自外源基因的RNA时，它会通过降解该RNA来抑制外源基因的表达。这种机制可以保护植物免受病原体侵害。[返回来源]

rdr6基因

它是参与RNA沉默机制和miR390-TAS3-ARF途径的重要基因之一，负责从单链RNA产生双链RNA。这种双链RNA最终被加工成小干扰RNA (siRNA)，从而诱导靶RNA的降解。通过这样的工作，rdr6基因在控制病毒防御和植物形态发生相关基因的表达方面发挥着核心作用。[返回来源]

TAS3

存在于植物基因组中的特定 DNA 序列，是称为 ta-siRNA（反式作用小干扰 RNA）的调节 RNA 的来源。从 TAS3 序列生成的 ta-siRNA 是ARF它通过控制基因等靶基因的表达，在植物的正常形态发生中发挥着至关重要的作用，并参与叶和花形状的形成。[返回源]

miR390–TAS3–ARF 通路

它是植物中一种重要的基因表达调控机制。 TAS3序列生成的RNA被一种名为miR390（一种具有调节基因表达作用的单链RNA）的小RNA切割，RDR6使用该RNA作为模板生成双链RNA。 Ta-siRNA 是通过切割该双链 RNA 生成的。这些ta-siRNAARF它调节基因（生长素反应因子）的表达，并在叶和花等器官的形成中发挥重要作用。该途径的正常功能对于植物形态和发育至关重要。[返回来源]

ARF基因（生长素反应因子基因）

一组转录因子，可响应植物激素生长素的信号调节基因表达。它们在控制叶子和花等植物器官的形成和生长方面发挥作用，对于植物的正常发育至关重要。[返回来源]

ta-siRNA（反式作用小干扰RNA）

A type of small RNA that plays a role in controlling the expression of specific genes after transcription该基因的独特之处在于，它源自与表达受控基因不同的DNA序列，它通过识别其他基因产生的互补mRNA并诱导其降解来抑制其表达。 It is involved in plant development, morphogenesis, and regulation of hormone responses[返回来源]

瞬态表达式

这是一种将所需的功能蛋白基因暂时导入植物体内，在短时间内产生功能蛋白的技术。功能性蛋白质可以在很短的时间内产生，例如基因导入处理后几天。[返回来源]