米乐m6官方网站（以下简称“AIST”）人工智能研究中心组学信息研究小组Hitoshi Ikebe，高级研究员，Satoshi Kameda，高级首席研究员，天野酶株式会社（以下简称“天野酶”）创新总部，前沿研究部，Satoshi Ishihara博士，Kazunori Yoshida博士，利用计算科学开发高纯度产品，可直接用作香料l-我们开发了一种可以合成薄荷醇的酶。
薄荷醇因其独特的薄荷气味、清凉作用、镇痛作用而被广泛用作化妆品香料和药品原料。近年来，薄荷醇的需求已无法通过从胡椒薄荷和薄荷中提取来满足，工业化生产已成为必需。薄荷醇具有很高的工业价值l-薄荷醇和味道和气味明显较差的副产品d-薄荷醇混合物，l-提高薄荷醇的纯度需要先进的化学合成工艺。因此纯度更高l-对于薄荷醇的工业合成，利用酶的底物特异性的基于生物技术的生产方法正在引起人们的关注。
这一次，l-一种有希望用于工业合成薄荷醇的候选酶洋葱伯克霍尔德菌AIST利用计算科学开发的基于脂肪酶（BCL）的酶修饰技术MSPER开发了一种新酶以传统 BCL 生成l-薄荷醇的纯度(光学纯度) 的 ee 约为 98% ee，低于用作香料所需的 99% ee，但当使用新开发的酶时，最高可达 994% eel-薄荷醇纯度。该酶采用经济优越的工艺开发而成，纯度高，对环境影响小。l-有助于薄荷醇的生产。
该技术的详细信息将于 2025 年 2 月 17 日发布。农业与食品化学杂志在线发布
薄荷醇是一种经济连锁反应较大的产品材料，由于其独特的薄荷气味、清凉作用和镇痛作用，用途广泛，包括用作化妆品香料和药品原料。预计2032年其市场规模将达到1193亿美元*最初，薄荷醇是通过从胡椒薄荷和薄荷中提取来生产的，但近年来，由于通过种植这些产品来增加产量已不足以满足需求，工业生产已变得至关重要。薄荷醇具有工业价值l-味道和气味明显较差的薄荷醇及其副产物d-以薄荷醇混合物的形式生产（示意图）。d-减少薄荷醇的比例，l-提高薄荷醇的纯度是工业合成中最重要的挑战，而实现这一目标需要先进的化学合成工艺。另一方面，近年来，利用具有仅与特定物质（底物）特异性结合并催化其化学反应的性质（底物特异性）的酶的生物技术的工业合成已引起人们的关注。l-在薄荷醇的生产中，脂肪酶和酯酶l-由于对提高薄荷醇的纯度有效而受到关注，并且已经对其工业用途进行了研究。 BCL 是本研究的主题，是领先的候选者之一。
作为香水l-为了直接使用薄荷醇产品，需要99% ee或更高的纯度，但在使用BCL的传统生产中，纯度仅为98% ee。是旋光异构体l-薄荷醇和d-由于薄荷醇具有非常相似的化学性质，因此很难在工业规模上分离和提高纯度，因此需要在制造阶段实现高纯度的BCL。
AIST 是分子动力学（MD）模拟和机器学习。作为这项工作的一部分，我们开发了 MSPER 方法来预测酶修饰位点，从而根据酶-底物复合物的结构信息来提高酶反应的特异性 (2021 年 10 月 4 日 AIST 新闻公告，参考文献）。这次，我们将这项技术应用到天野酶的商品化酶BCL上，以达到高纯度。l-我们开发了一种改进的BCL，可以生产薄荷醇。
这项研究和开发得到了国家研究开发公司新能源和产业技术开发组织 (NEDO) 委托项目“利用植物和其他生物开发高功能产品生产技术 (2016-2020)”的支持。
在酶改进研究中，我们的目标是通过创建修饰酶（突变体）来改善酶的功能，其中组成酶的一些氨基酸被其他氨基酸取代。 BCL由320个氨基酸组成，总共有20种氨基酸，因此有320 x 19 = 6,080种氨基酸被另一种氨基酸取代的变异模式。在这项研究中，AIST 使用计算科学方法l-通过缩小可能有助于提高薄荷醇纯度的氨基酸修饰位点，并显着减少天野酶进行的验证实验数量，我们缩短了开发周期并节省了劳动力。
BCL是薄荷醇的原料l-乙酸薄荷酯(l正文) 和d-乙酸薄荷酯(d来自12419_12430|身体)的混合物，l与身体特异性结合，l-生产薄荷醇。但是l身体和d因为身体结构非常相似d与身体连接d-可以产生薄荷醇（轮廓图）。为了提高酶的底物特异性，有必要识别与底物精细结构差异相对应的修饰位点。因此，有关酶-底物复合物结构的信息很重要。
使用 BCLl-薄荷醇生产的最大问题是缺乏预测变异所需的可靠的复杂结构信息。 BCL 和l身体，d与身体的复合物的结构迄今为止尚未通过实验确定。因此，在本研究中，我们将酶和底物单独存在于计算机上时的结构结合起来，并预测彼此的稳定复杂结构。对接模拟 (DS)创建了一个复杂的模型（图1右）。然而，当基于该模型进行MD模拟时，发现结构并没有保持稳定，而如图1左上所示，BCL的粉色部分接近浅蓝色部分并夹住基板的“封闭结构”更为稳定。迄今为止报道的所有 BCL 结构都具有开放结构，具有开放底物结合位点，但另一种类型的脂肪酶也报道了类似的封闭结构（图 1 左下）。这一结果表明DS模型不能准确反映实际的复杂结构，难以生成可靠的复杂模型。
图1 BCL开放结构和封闭结构
*原始论文中的数字被引用或修改。
因此，在本研究中，我们采用了一种方法，即使用MD模拟将复杂结构再现为由许多结构组成的“结构群”，而不是将其再现为单个模型或少量模型。当基于复杂结构预测修饰位点时，结构上的微小差异会对预测结果产生很大影响。另一方面，由于MD模拟生成的结构群包括多种酶-底物结合模式，因此可以在不依赖于特定复杂结构的情况下做出稳定可靠的预测。在本研究中，我们进行了基于封闭结构的MD模拟，以及BCL和l身体和d我们为每个身体生成了大约 35,000 个不同的复杂结构。
MSPER 是一种分析方法，可根据结构群体信息预测可提高酶选择性的修饰位点。当酶和底物结合时，与底物直接接触的氨基酸被认为在复杂结构的稳定性中发挥重要作用。因此，在 MSPER，l同时尽可能保持与身体的复合体d防止与身体形成复合物l与身体接触不多d输出经常与身体接触的BCL氨基酸的排名列表。在此排名中排名靠前的氨基酸的取代是l对与身体的结合影响不大，d人们认为它会破坏与身体的联系。这导致d-抑制薄荷醇的产生，l-您可以期望提高薄荷醇的纯度。
在MSPER提出的氨基酸位点中，我们总共创建了19个突变体，其中预测最有效的氨基酸之一被取代，并进行了验证实验。结果，l-不仅提高了薄荷醇的纯度（高达 994% ee），而且还提高了其转化率（图2）。是旋光异构体l-薄荷醇d-难以以工业规模分离薄荷醇并提高其纯度。因此，BCL 希望达到 99% ee 或更高的纯度，可以直接用作香料，但这次提出的变体超出了这一标准。在传统工业合成领域，拥有先进化学工艺的企业l-它占薄荷醇生产的大部分份额。这种酶的开发利用了酶在温和条件下特异性进行所需反应的能力，通过经济优越的工艺和低环境影响实现高纯度。l-您可以为薄荷醇的生产做出贡献。
图2 改进前的BCL（●）和五个改进后的BCL（○）的纯度和转化率
*这是对原始论文中的数字的引用或修改。
含有本研究中开发的改良酶的酶制剂正在由我们的联合研究合作伙伴天野酶公司进行商业化。高功能酶制剂的供应将导致经济上优越的工业工艺的发展，同时对环境的影响较小。通过利用基于计算科学的酶设计技术，我们将为实现生产节能、低成本的高性能产品的“智能细胞产业”做出贡献。
出版的杂志：农业与食品化学杂志
论文标题：洋葱伯克霍尔德菌在 L-薄荷醇生产中表现出增强的立体选择性的脂肪酶突变体
作者：Jinzen Ikebe、Kazunori Yoshida、Satoru Ishihara、Yoichi Kurumida、Tomoshi Kameda
DOI：101021/acsjafc4c09949
J。池部等人 科学。代表(2021) 11, 19004 DOI: 101038/s41598-021-98433-7