- 开发软件“GRable Version 10”以加速质谱糖蛋白组分析
- 实现与单个糖蛋白糖基化位点结合的各种糖链结构的“可视化”
- 用于药物发现种子搜索和抗体等生物制药的质量控制
开发了可以直观地掌握蛋白质上多个糖链的软件
*这是对原始论文中的数字的引用或修改。
米乐m6官方网站（以下简称“AIST”）细胞与分子工程研究部分子与细胞多组学研究组、首席研究员冈谷千秋、首席研究员富永大辅（现任明治药科大学教授）、技术人员富冈梓、研究员坂上博明、研究组组长久野敦、名古屋大学。糖生物学核心研究所糖大数据中心特聘教授梶裕之梶裕之（现任日本科学技术研究院客座研究员）、庆应义塾大学医学院特聘副教授高茂、特聘讲师合田纪夫（当时）。聚糖质谱糖蛋白组分析我们开发了可以自动分析数据的软件“GRable Version 10（以下简称GRable）”。糖肽识别的主流方法是两步质谱法（MS2），但AIST开发了一种通过一步分析（MS1）识别糖肽信号的方法（基于聚糖异质性的洗脱图谱上糖肽信号的关系识别（Glyco-RIDGE）方法），与MS2方法相比，可以进行更全面的分析。该软件支持基于 Glyco-RIDGE 方法的质谱分析。生物制药）的详细结构分析，也可用于大规模分析以寻找可作为药物发现种子的糖蛋白。该软件在网络上公开提供，可以免费使用 (发布软件“GRable”，加速质谱糖蛋白组分析）。该技术的详细信息将于 2024 年 9 月 30 日公布。分子与细胞蛋白质组学
为了提高患者的生活质量（QOL）并降低医疗费用，需要实现早期发现疾病并在疾病发生之前进行治疗的先发性医疗，以及考虑个体差异并提供高效且副作用少的治疗的个性化医疗。另一方面，糖链充当“细胞的面孔”，并根据细胞的状态而变化，因此糖链结构随疾病而变化的糖蛋白可以用作敏感地反映细胞病理的标记物和功能分子，并且可以用于开发能够实现先发性医疗的诊断剂和有助于个性化医疗的治疗剂。利用与这种疾病相关的聚糖变化聚糖药物发现识别与病理状况真正相关且对目标患病细胞高度特异性的糖蛋白（糖链和蛋白质的组合）非常重要。另一方面，与蛋白质和核酸相比，糖链结构多样、复杂，且数量较少，这给分析带来了很大障碍。在糖蛋白质组分析中，目前主流的基于糖肽衍生的碎片离子（产物离子）的基于MS2的分析方法可以对糖肽进行高度可靠的识别，但除非获得足够的MS2谱图进行分析，否则无法对糖肽进行识别，这在全面性上存在问题。
AIST 一直在开发使用凝集素的简单且高灵敏度的聚糖分析技术和使用质谱的详细结构分析技术，并构建了结合这些技术的多模式聚糖分析平台（参考文献 1）。当以糖蛋白作为治疗靶点时，重要的是要知道在创建抗体等目标探针时在哪个位置添加哪种类型的糖链（位点特异性糖型) 很重要。然而，由于糖链结构的多样性和复杂性，详细的结构分析极其困难，需要既全面又准确的分析方法。为了解决这个问题，AIST 开发了 Glyco-RIDGE 方法作为独特的位点特异性糖型分析方法（参考文献 2、图 1）。在本研究中，我们开发了软件“GRable”，利用质谱作为聚糖分析平台的基本技术来加速糖蛋白组分析。这项研究和开发是在日本医学研究与发展机构的“利用聚糖的创新药物发现技术开发项目（2016-2020）”的支持下进行的，该项目旨在开发基本药物发现技术以实现下一代治疗和诊断。
与目前主流的基于MS2的分析方法不同，Glyco-RIDGE方法具有基于MS1的分析方法的特点。基于液相色谱洗脱曲线和 MS1 质量差异将糖肽检测为簇，可以检测到比需要裂解的基于 MS2 的分析方法更少的糖肽量（图 1A、B）。在基于MS2的分析方法中，使用来自糖肽的碎片离子来鉴定肽序列，但在Glyco-RIDGE方法中，通过使用基于MS2的分析方法获得的肽序列列表来估计作为簇检测到的糖肽的肽序列（图1C）。由于该方法检测的糖肽没有断裂，因此比 MS2 方法更全面。
图1 Glyco-RIDGE方法原理及该软件的改进
具有相同肽序列的糖肽基团在液相色谱 (A) 中具有相似的保留时间。因此，保留时间在一定范围内且与糖单元质量相对应的质量差异的信号组被认为源自糖肽并被检测为簇（B）。这样，通过将基于MS1信息检测到的糖肽列表与单独准备的肽列表和糖链列表进行综合比较，我们估计出正确的组合（位点特异性糖型），并添加MS2信息来确定可靠性（C）。
*使用参考文献 2 中原始论文和图表的引用和修改。
在本研究中，为了利用质谱法加速糖蛋白组分析，我们开发了基于 Glyco-RIDGE 方法的自动化糖蛋白组分析软件“GRable”，作为聚糖分析平台的基本技术。 GRable 旨在通过可视化使用查看器检测到的糖肽簇来直观地掌握样品中糖肽的多样性（图 2）。
图 2 使用 GRable 可视化糖肽
人类 α1-酸性糖蛋白 (AGP) 分析中整个样品中的位点特异性糖型 (A) 和特定肽 (B) 的二维图。具有不同数量的附着唾液酸的糖肽也可以被检测为相同的簇（B）。
*这是对原始论文中的数字的引用或修改。
通过使用该软件分析模型样品的质谱数据，我们证明该软件可用于特定糖蛋白的详细结构分析以及含有多种糖蛋白混合物的样品（粗样品）的大规模分析。特别是那些肽只有一个残基不同的异构体的位点特异性糖型也可以单独检测（图3）。
图 3 使用 GRable 识别异构体
通过单独检测特定糖蛋白（AGP）的两种亚型，发现圆圈中所示的糖型的存在或不存在是不同的。
*原始论文中的数字被引用或修改。
基于 MS1 的分析的一个问题是，它检测的糖肽没有碎片，因此无法计算错误发现率，而错误发现率是可靠性指标。因此，GRable配备了将糖肽衍生碎片离子等MS2信息添加到每个分配的糖肽中的功能，从而可以可视化分析结果的确定性（置信度）（图1C）。
此外，当我们使用市售的基于 MS2 的分析软件对同一特定糖蛋白的质谱数据进行比较和评估时，GRable 估计的位点特异性糖型数量约为 4 倍，这表明使用 GRable 可以实现高度全面的分析。
鉴于上述情况，在本研究中，我们通过开发自动分析基于 MS1 的 Glyco-RIDGE 方法的软件，实现了更全面的位点特异性糖型分析，该方法可以检测使用现有的基于 MS2 的分析方法无法检测到的痕量糖肽。
该软件有望通过使用它来搜索药物发现种子来加速糖链药物发现的发展。此外，它在用于基因治疗的病毒载体的聚糖分析中也有使用记录（参考文献3），预计它不仅可用于抗体，还可用于生物制药新模式的质量控制。今后，产业技术研究所将更有效地整合具有自身优势的基于MS1的分析方法（Glyco-RIDGE方法）和基于MS2的传统分析方法，并继续开发覆盖范围和可靠性更高的分析方法及其软件。除了提高糖蛋白组分析的复杂度外，我们还将致力于开发新的聚糖分析技术作为基础技术，以进一步加强多模式聚糖分析平台。名古屋大学糖生物学核心研究所将在人类糖组计划（参考文献4）中利用该技术，全面阐明人体内存在的糖链的精确结构。
已出版的杂志：分子与细胞蛋白质组学
论文标题：GRable 版本 10：一种用于位点特异性糖型分析的软件工具，具有改进的基于 MS1 的糖肽检测、并行聚类和使用 MS2 信息的置信度评估
作者：Chiaki Nagai-Okatani*、Daisuke Tominaga、Azusa Tomioka、Hiroaki Sakaue、Norio Goda、Shigeru Ko、Atsushi Kuno、Hiroyuki Kaji*（*：通讯作者）
DOI：101016/jmcpro2024100833