米乐m6官方网站 (AIST) 生物医学研究部，Akira Sasaki，研究组组长，Naohiro Noda，研究组附件，油包水滴（以下简称“滴”）。这是一项可用于筛选以扩大生物制造中微生物资源的重要技术。
该技术应用于微生物膜膜染色荧光染料的本地化随着荧光强度的增加，可以检测到液滴内生长的微生物。使用比非染色更灵敏且取决于微生物数量的指数，我们实现了对生长有微生物的液滴的特异性检测和收集。使用该技术的微生物百万次放映”有助于加快微生物资源的寻找，加速生物制造，为生物经济社会的实现做出贡献。
此外，OnChip Biotechnologies Co, Ltd 已将该技术中使用的检测试剂商业化，并将于 10 月 1 日开始销售。
在生物制造领域，微生物等高度优化的细胞被用于制造生产过程。”智能电池''预计将生产。宿主细胞、基因、酶等微生物资源是工业智能细胞发展的基础，但尚未得到充分开发和利用。
从环境样本中寻找未培养的新微生物的主流方法是使用琼脂平板或烧瓶手动分离候选菌株一一分离。为了消除这一瓶颈，需要一种能够在短时间内对所用菌株的选育、培养条件的优化等进行综合评估的技术。为了满足更快微生物资源探索的需求，利用液滴技术进行百万次筛选正在引起关注。
百万次筛查需要开发技术来检测液滴中的微生物生长和目标产物。为了检测微生物的生长，有一种利用细胞自发荧光或与细胞外分泌物反应的试剂发光的方法。然而，自发荧光的强度并不能提供足够的检测灵敏度，并且检测细胞外分泌物的方法存在假阳性和由于周围环境带入的细胞外物质导致背景增加的问题。
AIST正在促进利用微生物的生物制造研究，并开发了用于百万次筛选的基础技术。这次，我们开发了一种使用专门对微生物膜进行染色的荧光试剂来检测液滴内微生物生长的技术，作为一项基础技术，使该技术更加先进，并具有广泛的应用前景。该检测方法可抑制背景增加并以高灵敏度捕获活细胞。
这项研究和开发得到了国家研究开发机构新能源和产业技术综合开发组织（NEDO）委托项目“开发生物基产品生产技术以加速实现碳循环（俗称生物制造项目）”（2020-2026）的支持。
液滴培养筛选技术是百万筛选技术的基础，该技术将微生物以液滴的形式在液体中培养，然后根据荧光、散射光等检测来选择性分选阳性液滴。在这项研究中，我们开发了一种技术，利用荧光试剂对微生物膜进行特异性染色，以高灵敏度检测微生物生长，同时抑制培养基成分引起的假阳性。这项新技术以最小的毒性直接对细胞进行染色，使得直接检测微生物生长成为可能。另外，随着微生物数量的增加，微生物膜的总量也会增加，因此这是一项允许膜染色根据存在的微生物的量（数量）来选择和分离微生物的新技术。
首先，我们使用微通道在油中生成水滴。此时，当与膜结合时荧光强度增加的膜染色试剂与介质一起被封入液滴中。我们研究了当细菌在液滴内生长时，这是否能让我们检测到荧光强度的增加。将制备好的液滴在37°C下培养过夜后，我们在显微镜下观察，发现其中生长了大肠杆菌的液滴发出强烈的荧光（图1）。
图1 膜染色试剂（绿色）和大肠杆菌封装并培养过夜的液滴（30 µm）的荧光显微镜观察
（左：暗视野显微镜图像，右：荧光显微镜图像）比例尺：100 µm
接下来，检测膜染色试剂染色的液滴中的微生物液滴分类器进行制备分离是可能的。液滴内微生物的存在也可以通过暗场显微观察来确认，但显微观察很难处理大量液滴，并且无法将它们分离。使用膜染色试剂进行荧光染色，可以使用液滴分选器进行高速分选（基于荧光强度的分选和分级）。通过测量每个液滴的荧光强度，我们能够区分不含微生物的液滴和内部生长有微生物的液滴。此外，通过使用膜染色试剂，我们能够清楚地检测到大肠杆菌的存在，尽管如果仅通过自发荧光而不使用试剂检测大肠杆菌的数量将很难检测到（图2）。此外，可以使用液滴分选器根据其荧光强度选择性地分选含有生长的微生物的液滴。在 90% 的液滴为空、其余 10% 含有大肠杆菌的情况下，通过仅分离荧光强度高的液滴，我们能够回收高达 100% 的含有微生物的液滴（图 3）。在培养和分选过程中，液滴可能会破裂并发生尺寸变化，但通过对尺寸发生变化的液滴进行分选，可以回收所需的液滴。
图2 使用和不使用膜染色试剂的大肠杆菌检测灵敏度比较（红色）
图 3 对用膜染色试剂（红色）和大肠杆菌封装并培养过夜的液滴（120 µm）进行分选
浅蓝色：空液滴（对照测量） 红色：大肠杆菌封装的液滴 比例尺：100 µm
使用该技术和该试剂，可以在数百万次筛选中轻松且高灵敏度地检测微生物生长。它对膜进行染色，而膜是微生物的基本组成部分，因此可用于多种细菌种类。因此，它可以作为在含有多种微生物的环境中寻找有用的微生物以及培育微生物的基础技术。一个例子是通过将环境中的各种微生物单独封装在液滴中来筛选它们。在仅具有有用功能的微生物生长的特定条件下进行培养，并分选并获得含有观察到在该条件下生长的稀有有用微生物的液滴。分选收集的液滴可以一一分离到96孔板中，可用于大规模培养。
该检测技术所使用的检测试剂将由OnChip Biotechnologies Co, Ltd商业化，并于10月1日起开始销售。
除了扩大应用范围并使用该试剂开发有用的应用之外，我们还将努力进一步加强和改进该技术。此外，我们还将针对生物制造企业提出的使用该检测技术的要求，共同解决问题。
JP 2024-018130“用于检测微生物生长的方法、用于获得微生物的方法、用于检测微生物生长的试剂盒、用于获得微生物的试剂盒以及染料作为微生物生长报告基因的用途”（公开日期：2024年2月8日）