- 一种通过应用拉曼光谱评估神经元和神经细胞群活动的方法，拉曼光谱通过散射光检查物质分子
- 准确测量神经活动生成的光谱数据并使用机器学习评估神经状态的技术
- 应用于新药开发、再生医学中的细胞质量控制、生物制造中的微生物评估等的可能性
新开发的“应用拉曼光谱的神经元活性评估系统”概要图
*这是对原始论文中的数字的引用或修改。 （一些插图是使用 Biorendercom 创建的）
米乐m6官方网站（以下简称“AIST”）细胞与分子工学研究部干细胞生物技术研究组研究员赤木由香、木田康之研究组附件、典本彩技术人员开发出一种可以评估神经细胞活性的新方法。
传统上，评估神经元活动的技术需要荧光探针作为指示剂。因此，在本研究中拉曼光谱机器学习，我们开发了一个可以快速准确评估神经元活动的系统。该系统不仅可以测量单个神经元，还可以测量神经元成组活跃的神经核。不需要探针的非侵入性神经元评估系统将有助于再生医学和药物发现中移植细胞的质量控制，以及新药的疗效和毒性评估。此外，这项技术可以帮助开发神经系统疾病的治疗方法并推进神经科学。
该技术的详细信息将于 2024 年 7 月 3 日公布。分子
神经细胞组成神经系统，包括大脑和脊髓，具有将外部物理和化学信号转换为电信号并将其传输到肌肉等各种细胞和组织的作用。迄今为止，准确评估神经活动的技术已取得进展，旨在分析神经功能和阐明病理状况。例如，有一些方法通过用荧光分子标记来测量钙离子和与神经细胞活动同步的特定物质的变化，以及通过将薄玻璃电极插入细胞来测量神经电活动的方法。然而，这些可能会损害细胞和组织。但也存在测量费工、费时、成本高等问题。在此背景下，需要一种无需使用荧光探针或电极即可轻松准确测量神经元活动引起的分子变化的技术。
AIST一直在推动干细胞操作技术以及再生医学和药物发现支持的质量控制和评估技术的研究和开发，以实现生物技术的产业化。特别是，我们致力于解决传统评估技术的问题，例如细胞损伤、测量时间长和成本高。我们专注于拉曼光谱，并与 AIST 和大阪大学先进光子学和生物传感开放创新实验室合作开发了一种新的细胞评估技术。拉曼光谱是一种从目标物体被激光照射时散射的光（拉曼散射光）获得有关目标物体的分子信息的方法。从细胞中获得的拉曼光谱全面包含了细胞内核酸、蛋白质、脂质等各种分子的类型、结构和数量等信息。我们开发了一种高速扫描激光并获得高灵敏度拉曼光谱的技术。通过该系统，激光束可以以螺旋模式扫描整个目标区域。通过缩短激光照射时间，可以减少对细胞的热损伤，从而可以有效地获取整个细胞的光谱。我们有这个系统油漆拉曼快速光谱系统 (PRESS)并使用各种细胞进行了演示实验（参考文献）。
现在，我们进一步开发了这项技术，开发出了一种新技术，可以让我们轻松地实时评估神经元活动，而这在以前是很困难的。
这项研究得到了日本学术振兴会科学研究补助金 (19K23613) 的部分支持。
近年来，拉曼光谱已被用作识别免疫细胞和干细胞等细胞类型并评估其活性的技术。然而，目前还没有使用拉曼光谱来检测神经元活动的暂时和微小变化的具有挑战性的研究。如果能够用探针对神经细胞进行非破坏性、无创性的评估，将有助于再生医学中神经细胞的质量控制、神经疾病新药的开发、毒性评估的效率以及神经科学研究（图1）。因此，我们研究组开发了独创技术：诱导多能干 (iPS) 细胞创建神经元（根据 AIST 伦理委员会关于使用人类样本进行实验的指导方针进行）并研究了一种使用 PRESS 测量神经元的方法。另一方面，在大脑、脊髓和周围系统中，神经细胞形成神经核，作为一个整体发挥作用。我们需要一种技术，让我们能够轻松测量这组神经元的活动。因此，我们研究了一种方法，可以显着扩大 PRESS 中激光束的扫描范围，并从更广泛的区域以高灵敏度测量光谱。结果，我们成功地在短短几秒钟内测量了特定区域内多个细胞的集成光谱。
图1 神经元活动评估方法的比较：使用传统荧光探针和电极的方法与使用新开发的拉曼光谱的方法
*这是对原始论文中的数字的引用或修改。 （一些插图是使用 Biorendercom 创建的）
在实验中，我们首先对单个神经元进行了测试，以验证 PRESS 是否可以评估神经元活动（图 2，顶行）。构成大脑的细胞之一谷氨酸能神经元由人类 iPS 细胞产生并用于测量。当该神经对谷氨酸做出反应时，细胞中钙离子的浓度发生变化，从而改变其电活动。因此，我们获得了对谷氨酸溶液有反应的神经元的拉曼光谱。这是一种统计分析方法，使用从 30 个神经元获得的光谱信息，每个神经元对对照溶液（缓冲溶液）或谷氨酸溶液有反应主成分分析降维和机器学习方法支持向量机计算（图2上排）。结果，对对照溶液（对照细胞）做出反应的神经元和谷氨酸刺激的神经元的分类准确度为 98%。这证实了PRESS可以高精度检测谷氨酸溶液引起的神经元活动变化。
接下来，我们验证是否可以测量神经元成组活跃的神经核（图 2，底行）。由人类 iPS 细胞生成用于测试自主神经细胞自主神经细胞是控制兴奋和放松等身体活动的神经系统。在体内，神经细胞以成群活跃的神经元核的形式存在，由人类iPS细胞产生的自主神经细胞也呈现出数十个神经细胞聚集体的形式。为了评估这些神经聚集体的功能，我们改进了PRESS测量方法，建立了一种可以在几秒钟内获取由多个细胞组成的大面积拉曼光谱的方法。具体来说，我们将测量区域扩大到49倍，并调整了激光束扫描速度和曝光时间。我们还研究了高信噪比测量光谱的条件。拉曼光谱是从 30 个区域获得的，每个区域都来自对激活自主神经细胞的尼古丁溶液或对照溶液做出反应的神经聚集体。当使用机器学习分析获得的光谱数据时，我们能够以 98% 的准确度区分对对照溶液（对照组）做出反应的神经聚集体和对尼古丁溶液做出反应的神经聚集体（图 2，底行）。此外，我们能够检测特定的拉曼标记作为分子信息，有助于尼古丁刺激下的神经活动。具体而言，波数740cm，表示核酸等。-11121 厘米-1，994 cm 有助于核酸和蛋白质的磷酸盐-1，2848 厘米有助于脂质-1由于尼古丁反应，峰值显示出强度差异。
图 2 使用拉曼光谱对单个神经元或神经元聚集体进行活性评估
顶行）显示测量单个神经元时的明场图像以及从该细胞获得的光谱数据。这些数据是利用统计分析方法之一的主成分分析将高维数据转换为三维数据而得到的图表。在图中，对照细胞显示为黑色圆圈，对谷氨酸有反应的神经元显示为红十字（一张图显示一个细胞）。激光束高速扫描明场图像中的绿线，以获得该区域内的积分拉曼光谱。 （比例尺：10 毫米）
底行）显示测量神经元（多个神经元）聚集体时的明场图像以及从细胞获得的光谱数据。这些数据还使用主成分分析将高维数据转换为三维图形。该图将对照组显示为黑色圆圈，对尼古丁做出反应的神经元组显示为绿色十字（一张图表示一种聚集体）。 （比例尺：50 毫米）
*使用了原始论文中的图表（图 1、图 4）的引用和修改。
此外，PRESS 能够评估依赖于尼古丁浓度的神经元活动（图 3）。这被认为是由于对尼古丁做出反应的神经元比例以及细胞内的变化根据尼古丁浓度而不同的结果。
图3 尼古丁浓度依赖性神经聚集活性变化的分析结果
拉曼光谱是从对 005 µM 至 500 µM 尼古丁有反应的神经元聚集体中获得的，并使用称为偏最小二乘判别分析 (PLS-DA) 的机器学习方法进行分析。
左) PLS-DA 分析结果以二维形式显示，每个浓度的数据以核密度估计图形式显示。显示了响应不同尼古丁浓度的神经聚集体的分布。
右) 显示基于 0 µM 尼古丁浓度比较 PLS-DA 评分值的结果。它显示了每个浓度下神经活动的变化量，并且在高浓度尼古丁下检测到特别显着的变化。 (*P<005 vs 0 µM，n=24，Williams 的事后测试）
*原论文中的图（图7）是引用并修改的。
在这项研究中，我们不仅成功地快速准确地评估了单个神经的活动，而且还成功地评估了一组神经的活动。该技术允许在维持细胞培养基等生长环境的同时进行测量，并且不需要荧光探针等测量标签。因此，它有助于细胞治疗中细胞产品的质量控制，有望在未来发展，并有助于降低制造成本并提高治疗的安全性和有效性。在药物发现领域，它有助于提高新药开发和毒性评价的效率。
这项技术不仅可以应用于神经细胞，还可以应用于各种培养细胞和微生物群体。因此，它有望在生物制造等其他生物产业中具有广泛的应用，例如利用培养细胞开发功能性食品、实时评价微生物的代谢活性以及有用材料的生产力评价，并具有解决许多问题的潜力。此外，细胞评价等体外评价技术的发展将有助于减少动物实验的社会趋势，也有助于创建高效、道德、成熟的研究环境。
未来，我们将继续改进这项技术，旨在通过自动化测量和分析来快速、低成本且高精度地评估细胞活性。具体来说，我们将应用机器人技术和图像分析技术来实现多个样品的自动测量。我们还将采用尖端光学技术来提高拉曼测量的灵敏度和时间分辨率。未来，我们将考虑将该技术用于药物发现领域的新药开发和毒性评价，以及生殖医学领域的无损胚胎评估。
已出版的杂志：分子
论文标题：使用拉曼显微光谱法对神经元活动进行无标记评估
作者：Yuka Akagi、Aya Norimoto、Teruhisa Kawamura、Yasuyuki S Kida
DOI：103390/分子29133174
Yuka Akagi、Nobuhito Mori、Teruhisa Kawamura、Yuzo Takayama 和 Yasuyuki S Kida，“使用 Paint 拉曼快速光谱系统 (PRESS) 进行非侵入性细胞分类”，科学报告。 11, 8818, 2021
DOI：101038/s41598-021-88056-3