- 病毒被吸附到羟基磷灰石颗粒上，与检测抑制成分分离，并通过PCR进行高灵敏度检测
- 多点空气采样，估算畜舍内外病毒的浓度和空间分布
- 评估由于空气传播感染和飞沫感染而传播到邻近谷仓的风险，这很难通过测试每头牛来评估
使用湿旋风空气采样器采集空气传播病毒的图像（左）和牛舍内外病毒分布的图像（右）
*牛棚照片是Photo AC的免费素材。病毒分布图是讲座论文中图表的部分修改版本。
8445_8623气雾剂我们进行了采集实验，证明可以检测到漂浮在太空中的病毒，也可以检测到已经传播到邻近牲畜厩附近（上图右侧邻近牲畜厩前）的病毒。
在这项研究中，我们通过开发一种称为 PTAS（空气传播标本预处理技术）的样品预处理方法来建立空气传播病毒检测方法，该方法可有效浓缩和去除检测抑制剂。因此，通过将空气中气溶胶的高效收集与病原病毒核酸的高灵敏度检测方法相结合，我们证明了即使在含有干扰检测的灰尘和动物代谢物的样品中也能检测出病原病毒。此外，通过在畜舍内外多个位置同时测量，能够估计病原病毒的浓度和空间分布，从而可以直观地了解病毒传播到邻近畜舍的风险。该技术将通过识别致病病毒并验证畜牧生产场所的传播途径，有助于防止传染病的传播。
这项技术的详细信息将于 2023 年 11 月 6 日至 8 日在熊本城大厅（熊本县熊本市）举行的第 40 届“传感器微型机械和应用系统”研讨会上介绍。
经历了冠状病毒大流行后，我们变得非常担心空气中漂浮的病毒的存在以及由它们引起的感染风险。因此，为了防止传染病在人们周围的社会中传播并确定感染途径，人们进行了许多研究，例如使用超级计算机进行飞沫扩散模拟和使用气溶胶收集进行病毒检测。另一方面，畜禽传染病技术开发利用还不够。近年来，日本爆发了多起对畜牧业造成重大影响的传染病，如2022-2023年爆发的禽流感、猪瘟等，至今仍让人记忆犹新。 2018年修订的《家畜传染病防治法》明确规定，畜主有责任“预防传染病发生、蔓延的卫生管理”，并规定国家、县、市必须制定传染病防治规划、措施和制度。在此背景下，农林水产省将一项公共项目的主题定为“可视化”生产现场传染病爆发的风险，并开发和示范风险控制技术。人们强烈希望开发可应用于畜牧生产现场的有效病毒检测技术，并通过其使用制定防疫措施。
自 2020 年以来，AIST 一直在开展基于人流和行为分析的空气传播病毒感染风险评估研究，以应对冠状病毒大流行。我们还开发了捕获和检测空气传播病毒的技术。在畜牧业中，病毒感染在全球范围内造成的损害已成为一个社会问题。为了防止牲畜传染病造成的损害，我们开发了将AIST开发的病毒检测方法应用于畜牧生产现场的技术，并验证了其在畜牧生产现场的适用性。
这项研究的特点是收集和检测畜舍内外空气中漂浮的病毒。我们不再像过去那样诊断每只牲畜是否被感染，而是调查牲畜舍内外的空间是否漂浮着待检测的病毒。传统的疾病诊断包括从一群疑似患有传染病的牲畜中选择几只动物，收集有代表性的体液（血液、鼻腔分泌物等），并检测病原体。因此，只有当感染真正扩散到周边地区时才能检测到感染的实际扩散，而很难在感染扩散前预测和验证传播途径等“传播风险可视化”。
采用新开发的“PTAS法（空气样本预处理技术，图1）”的空气传播病毒检测方法包括1）使用湿旋风空气采样器收集漂浮在空气中的病毒，2）使用吸附病毒的细颗粒浓缩目标病毒，并消除牲畜来源材料（例如粪便和尿液）和灰尘等病毒检测的障碍（PTAS法）聚合酶链式反应 (PCR)对病毒核酸进行定量分析。通过与畜牧卫生中心单独进行的鼻分泌物和血液检测以及空气样本病毒分离结果进行比较，验证了结果的有效性。
PTAS法中，样品通过孔径为045μm的注射器过滤器过滤，除去大固体，然后将具有高蛋白质吸附性能的羟基磷灰石颗粒添加到滤液中并充分搅拌。由于病毒颗粒表面的外部蛋白质被羟基磷灰石颗粒吸附，因此通过对病毒吸附颗粒进行离心，可以有效地浓缩和除去检测抑制剂。此外，通过从吸附在颗粒上的病毒中提取并纯化病毒核酸，可以使用PCR检测有效地检测核酸。
图1 使用开发的PTAS方法进行空气传播病毒检测流程
*图中使用了来自插图AC的免费材料。
首先，在茨城县的一个农场，确认了一头疑似持续感染牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 的小牛，在隔离小牛的棚内收集空气（图 2a），以确认是否可以检测到传染性病毒 (BVDV)。结果，我们通过应用PTAS方法对从小屋内采集的样本成功检测了BVDV病毒核酸。此外，还使用了小牛的血液和鼻腔分泌物效价测量BVDV 检测呈阳性。另一方面，传统的PCR检测无法检测到空气样本中的病毒。这表明新开发的PTAS方法对于检测畜牧场样本中的病毒是有效的。
接下来，在茨城县的一个与上述农场不同的农场，我们在确认有大量出现呼吸道症状的小母牛舍内的奶牛舍内外的 3 个地点进行了同时采样（n=3），并对可能成为牛呼吸道疾病综合症致病病毒的 7 种牛病毒进行了检测测试。
图2 a) 隔离区疑似感染犊牛的采集，b, c) 小母牛舍内外三点两种病毒（灰条：D型流感病毒[IDV]，蓝条：牛腺病毒3型[BAdV3]）检出频率趋势（b：流行期，c：1个月后）。每个测量点的柱状图的高度代表检测频率，椭圆的颜色密度是估计的病毒浓度和空间分布的图像。
*这是讲座论文中的图形的部分修改版本。
在第一次采集时，检测的 7 种牛病毒中，检测到了 D 型流感病毒（IDV，检测频率如图 2b 和 c 中的灰色条所示）和 3 型牛腺病毒（BAdV3，检测频率如图 2b 和 c 中的蓝色条所示）。另外，如图2b疫情期间柱状图所示，牛棚（有症状奶牛所在区域）的检出频率（同一地点3个样本的阳性率）最高，其次是牛棚的背风面和相邻牛棚前的区域，检出频率依次递减。此外，在与空气样本同时采集的牛鼻分泌物样本（注1）中也检测到了这两种病毒类型（A、B），证实检测到了感染牛舍内小母牛的两种病毒。感染有症状牲畜的病毒的检测频率取决于风向，并且也在相邻的牛棚前面进行检测，从而可以通过同时多点测量估计空气传播病毒的浓度和空间分布，从而“可视化传播风险”。
(注1)将牛鼻分泌物样本接种到MDBK细胞中，盲传，上清液进行PCR检测。
此外，一个月后，当在同一牛棚内进行类似测量时，如图2c所示，IDV和BAdV3的检测频率均下降，且在相邻牛棚前均未检测到。此时，出现流鼻涕等症状的人数正在减少，人们认为疫情的情况已经反映在检测频率上。
通过这项努力，我们展示了新开发的病毒采集和分析方法在畜牧生产场所的适用性，并证明了其作为一种技术的有效性，可以在感染传播之前预测传播途径和进行风险控制，而这是当前检测系统难以做到的。
此外，我们在猪舍空气传播和检测猪病毒的示范实验中成功检测到了猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），这项研究预计不仅适用于牛舍，还适用于猪舍、鸡舍等。
这样，我们就建立了一种从畜舍内外空气样本中检测罕见病毒的技术，这是以前很少尝试过的，可以说，这项技术有希望成为早期发现和预防传染病传播的有效手段。
我们将进一步开发已开发的技术，并开展禽舍病毒检测示范工作。与牛舍和猪圈相比，禽舍的空间内含有更多的牲畜来源物质和灰尘。杂项浓度越高，病毒预计就越难检测。通过开发新技术，我们的目标是开发有助于预防禽流感等可能造成巨大损害的疾病的方法和系统。我们也在寻找设备开发制造商、农民等合作伙伴，共同进行技术开发和示范，我们将继续对技术进行示范并推动早期社会实施。