米乐m6官方网站（AIST）生物过程研究部植物功能控制研究组的高级研究员中村明吉（Akiyoshi Nakamura）和菅野繁夫（Shigeo Kanno）与凸版印刷株式会社（以下简称“凸版印刷”）和Inplanta Innovations Co, Ltd（以下简称“Inplanta”）合作开发了由钛酸钾制成的针状晶体（晶须)和超声波CRISPR-Cas9的核糖核蛋白 (RNP)进入植物。
在之前的研究中，已知有一种技术使用称为晶须的微型“针”直接在植物细胞中打孔并将 DNA 引入其中。但基因组编辑工具RNP能否引入尚不清楚。在这项研究中，我们找到了允许引入 RNP 的条件并创造了基因组编辑水稻。与使用细菌的基因导入方法相比，将基于晶须的基因组编辑工具引入植物中对植物的生物学特性的依赖性较小，使得使用RNP在多种植物物种中进行基因组编辑成为可能。研究还表明，通过使用晶须超声 RNP 方法，可以在完全不使用 DNA 的情况下编辑水稻细胞的基因组。
这种编辑技术是构建一个平台的新步骤，用于对通常难以转化的植物进行基因组编辑，而无需使用 DNA。
该技术的详细信息将于 2023 年 9 月 7 日（日本时间）公布。科学报告
随着全球变暖和粮食问题引起人们的关注，比以往任何时候都更有必要利用植物的力量来实现可持续发展的社会。因此，人们对基因组编辑技术改善植物的期望很高。用于植物基因组编辑，感染植物的细菌农杆菌指定要编辑的内容引导RNA是一种常见的做法。或基因组编辑工具Cas9。然而，当农杆菌被使用时，它会将DNA整合到植物的基因组中，这可能会给植物带来意想不到的问题。此外，由于社会风险，一些国家限制植物源细菌的使用。在此背景下，需要尽可能不使用DNA或农杆菌的植物基因组编辑技术。迄今为止，已经设计了几种方法，但由于它们需要先进技术的积累，因此尚未得到广泛应用。
在改善植物功能的研究和开发中，AIST 使用基因改造来控制植物原有基因的功能。例如，通过抑制产生雄蕊和雌蕊的基因的功能，我们可以2010 年 3 月 16 日 AIST 新闻稿)，通过控制叶表面气孔的打开和关闭来耐受臭氧的植物(2016 年 3 月 29 日 AIST 新闻稿) and others have been developed
要在社会上实现上述成果，不仅基因重组有效，基因组编辑技术也有效。由此，我们开发了超声波晶须RNP方法，一种新型植物基因组编辑技术。
2005 年开发的晶须超声方法（Terakawa 等人，2005）是一种将 DNA 直接输送到植物细胞中的技术，可应用于大豆、水稻、玉米、橡胶和蓝猪耳等多种植物物种。此方法使用大米胚等的大量细胞，我们使用晶须（一种细长的针状晶体）在细胞中打孔并引入基因（点图）。混合晶须和细胞团块时应用超声波可以提高基因转移的效率。与农杆菌法（生物法）不同，该方法直接在细胞中制造孔隙，因此可以应用于多种植物。然而，到目前为止，只引入了基因（DNA），尚不清楚是否可以将蛋白质或其他分子引入植物中。
AIST、Toppan Printing 和 Inplanta 以大米为研究材料，首先验证晶须超声方法是否可以应用于引入由蛋白质和 RNA 组成的基因组编辑工具。通过AIST的大规模蛋白质和RNA制备技术，米饭PDS我们准备了旨在破坏该基因的指导 RNA 和 Cas9 蛋白。在用它们生产核糖核蛋白 (RNP) 后，我们研究了是否可以使用 Inplanta 成熟的晶须超声方法将 RNP 引入植物细胞中（见图）。含有耐药基因质粒 DNA将RNP和RNP同时导入来自稻胚的细胞团中，并使用药物选择导入了RNP的细胞。通过制备各种RNP浓度并检查用该药物选择的水稻细胞，我们发现基因组编辑效率在一定浓度下有所提高，从而可以创造出效率与农杆菌方法相当的基因组编辑水稻。我们将这种优化RNP浓度的基因组编辑方法命名为“晶须超声RNP法”。
接下来，研究晶须超声RNP方法是否可以应用于迄今为止尚未尝试过基因组编辑的基因类胡萝卜素这是一个合成基因米饭LCYB我们通过基因组编辑破坏了该基因（图 1）。在使用晶须超声RNP方法同时引入RNP和耐药基因表达质粒DNA的细胞中，观察到基因组编辑，以及番茄红素积累和红色素沉着的增加。这个结果是基于大米LCYB这是第一个例子，表明当基因因基因组编辑而被破坏时，番茄红素会在水稻中积累。米饭LCYB该基因被认为是从番茄红素合成β-胡萝卜素所必需的，我们可以说这已经得到证实。
图1 使用晶须超声RNP方法创建的水稻LCYB突变体及其色素沉着状态
*这是对原始论文中的数字的引用或修改。
最后，我们研究了是否可以使用晶须超声RNP方法进行基因组编辑，而无需同时引入耐药基因质粒DNA。使用晶须超声波 RNP 方法仅引入含有针对水稻 PDS 基因的指导 RNA 的 RNP，凸版印刷的提案下一代测序的基因组时，检测到基因组编辑，尽管效率较低（约03%）。这一结果表明，利用晶须超声RNP方法，可以在不引入任何DNA的情况下编辑植物基因组。未来，我们希望通过与RNP同时添加耐药分子来提高效率。完全不使用任何DNA的基因组编辑作为一种社会接受度较高的技术而受到关注，因为它最大限度地减少了植物基因组中发生意外基因重组的可能性。这项研究成果是向不使用DNA的植物基因组编辑技术迈出的新一步。
众所周知，晶须超声方法适用于多种植物物种。因此，晶须超声RNP方法也可以成为许多植物物种的基因组编辑技术。
未来，我们将利用晶须超声波RNP方法进行基因组编辑，应用于大豆、小麦、玉米等谷物，以及难以进行基因组编辑的各种草类和各种树木，为阐明基因功能做出贡献。此外，通过提高完全不使用任何DNA的基因组编辑效率，我们将提供一个技术平台，用于创建对社会安全可靠的基因组编辑品种。
已出版的杂志：科学报告
论文标题：超声辅助晶须方法使 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白递送能够诱导水稻基因组编辑
作者：Akiyoshi Nakamura、Tsubasa Yano、Nobutaka Mitsuda、Maiko Furubayashi、Seiichiro Ito、Shigeo S Sugano、Teruhiko Terakawa
DOI：101038/s41598-023-40433-x
“编辑植物基因组的方法、使用该方法的基因组编辑的植物和植物种子及其生产方法”
国际申请号：PCT/JP2022/043204
申请日期：2022 年 11 月 22 日