Katsura Zaitsu，近畿大学物理与工程学院教授（和歌山县纪之川市），国家先进产业技术研究所（茨城县筑波市）高级研究员，Ryo Iguchi，三菱田边制药公司（神奈川县藤泽市）首席研究员，Yui Hibino 的研究小组是代谢组分析※2和生物信息学※3由于药物等的副作用而发生药物性肝损伤※4原因，线粒体毒性机制的指示分子。这项研究的结果有望在未来应用于药物发现研究中建立新的药物毒性评价方法。
该研究结果将于 2022 年 12 月 1 日星期四上午 8:45（日本时间）发表在国际毒理学学术期刊上。毒理学和应用药理学”
利用代谢组分析和生物信息学确定线粒体毒性机制的图像
药物性肝损伤是药物副作用引起的肝脏炎症。如果服用药物的患者发现药物性肝损伤，可能会导致药物释放的取消或新药开发的暂停，因此适当预测药物性肝损伤的风险非常重要。
药物性肝损伤的主要原因之一是线粒体毒性。线粒体是细胞内细胞器之一，也被称为细胞的“能量生产工厂”。这种导致线粒体功能障碍的特性称为线粒体毒性。
传统上，通过将培养的细胞暴露于药物并观察线粒体形态并测量细胞耗氧量来评估药物的线粒体毒性。然而，为了预测药物性肝损伤的风险，需要确定线粒体毒性的机制，而常规的评估方法是不够的。为了更精确地确定线粒体毒性的机制，分子概况※5建立评估方法因此，该研究小组一直在开发一种结合代谢组分析和生物信息学的新技术。
研究小组将人类肝癌来源的细胞系（HepG2细胞）暴露于四种具有不同毒性机制的化合物中，目的是鉴定可作为确定线粒体毒性机制的指标的分子。代谢组学分析的结果是，他们鉴定出了 125 种代谢物。生物信息学分析表明，这 125 种成分的分子谱因线粒体毒性机制的不同而存在很大差异。
此外，利用生物信息学，我们缩小了 50 个分子的范围，并使用机器学习对其进行了验证，从而确定了线粒体毒性的机制。指示分子※6
这项研究是通过代谢组学分析确定线粒体毒性机制的突破性结果。此外，本研究确定的指示分子有望应用于未来的药物发现研究，以建立新的药物毒性评价方法。
已出版的杂志：
毒理学和应用药理学
（影响因子：446＠2021）
论文标题：线粒体毒性机制分类的初步研究
体外代谢组学和生物信息学
（体外代谢组学和生物信息学对线粒体毒性机制分类的初步研究）
作者：日比野由衣
1，井口亮
2，桂财津
3＊＊通讯作者
附属机构：1 田边三菱制药株式会社、2 国立先进产业技术研究所、3 近畿大学物理与工程学院
在这项研究中，我们注射了线粒体毒性化合物（鱼藤酮、奈法唑酮、CCCP、哌克昔林）和阳性对照化合物（洋地黄皂苷），进行代谢组学分析，将生物信息学应用于获得的多变量数据，并尝试识别有助于确定线粒体毒性机制的分子。
当使用细胞评估肝损伤等时，通常使用人肝癌来源的细胞系，因为它们易于培养和传代。然而，与正常细胞不同，癌症来源的细胞据说具有增强的有氧糖酵解（瓦伯格效应）。换句话说，在癌症来源的细胞中，糖酵解加速，线粒体中通过 TCA 循环产生的 ATP 往往受到抑制。因此，为了使用 HepG2 细胞（一种源自人类肝癌的细胞系）分析线粒体毒性的分子谱，抑制癌细胞中发生的 Warburg 效应非常重要。
在本研究中，我们参考之前的研究，通过将HepG2细胞的培养条件从正常葡萄糖培养基改为半乳糖培养基来抑制Warburg效应。此外，使用线粒体 ToxGlo 检测优化了每种化合物的暴露浓度，该检测可以同时评估细胞毒性和 ATP 生成，在未观察到细胞毒性的条件下，将 ATP 生成减少至约 50%。
对暴露于这些优化浓度的每种化合物的 HepG2 细胞（每种化合物 n=15）和仅暴露于溶剂 (DMSO) 作为对照的 HepG2 细胞（n=15）进行代谢组学分析，鉴定出 125 种代谢物。这是对所获得的代谢组数据的多变量分析之一潜在结构投影判别分析 (PLS-DA)※7结果如图1所示。
图 1 对暴露于每种化合物的 HepG2 细胞和仅暴露于溶剂 (DMSO) 的 HepG2 细胞的代谢组分析获得的数据进行多变量分析 (PLS-DA) 的结果
蓝色和绿色圆圈表示呼吸链复合物抑制（鱼藤酮、奈法唑酮），橙色圆圈表示解偶联 (CCCP) 基团。未偶联的呼吸链复合物（由紫色虚线圈出）（由橙色虚线圈出）与 β-氧化抑制剂（哌克昔林）、阳性对照（洋地黄皂苷）和溶剂 (DMSO) 组（由红色虚线圈出）完全分离，这意味着它们的分子谱不同。
图1的结果显示，呼吸链复合物抑制（鱼藤酮和奈法唑酮）和解偶联（CCCP）的分子谱与其他组很好地分开，表明分子谱是不同的。另一方面，β-氧化抑制（哌克西林）与阳性对照（洋地黄皂苷）和仅媒介物（DMSO）暴露组没有明显区分。其原因可能是本研究中使用的细胞培养条件没有提供足够的β-氧化途径所需的脂肪酸供应，从而难以评估β-氧化抑制的效果。
此外，重点关注与线粒体能量产生相关的糖酵解系统和 TCA 循环代谢途径分析※8的结果如图2所示。
图2代谢途径分析结果（A：糖酵解，B：TCA循环）
以蓝色和绿色显示的呼吸链复合物抑制（鱼藤酮和奈法唑酮）在糖酵解系统 (A) 中显示出较低的值，包括从葡萄糖 6-磷酸到丙酮酸的途径（A 中的红色背景）和 TCA 循环（b 黄色背景）。另一方面，解偶联（CCCP）在TCA电路的一部分（B中黄色背景的部分）中显示出高值。
代谢途径分析的结果还证实，呼吸链复合物抑制（鱼藤酮和奈法唑酮）和解偶联（CCCP）在糖酵解和 TCA 循环组成分子的行为方面与其他组明显不同。
从上述结果可以清楚地看出，通过对 Warburg 效应受到抑制的 HepG2 细胞进行代谢组学分析，可以在分子水平上鉴定不同的线粒体毒性机制，即呼吸链抑制和解偶联。
此外，PLS-DA 将可用于确定线粒体毒性机制的有用分子缩小到 50 个成分，这 50 个成分被用作一种机器学习。随机森林※9验证判别模型的结果是，各组的判别精度为鱼藤酮094、奈法唑酮087、CCCP 093、哌可西林090。由于洋地黄皂苷显示出083的值，溶剂(DMSO)显示出094的值，因此表明，如果这50种成分是作为“指示分子”，有可能确定线粒体毒性机制。
这也是对获得的多元数据进行数据驱动的分析相关网络分析※10已经完成了。结果如图3所示。
图3相关网络分析结果
此处，以相关系数(R)>075为标准。根据介数中心性指数，每个节点（圆）的大小显示为大。
通过使用从相关网络分析结果获得的介数中心性指数，可以可视化在代谢网络内具有影响力的“枢纽分子”。在这里，琥珀酸、3-氨基丙酸和谷氨酸被确定为中心分子，可以作为呼吸链复合物抑制和解偶联的更好指标。
这项研究代表了通过代谢组学分析识别线粒体毒性机制的突破。此外，本研究论证的指示分子未来很有可能应用于药物发现中新的毒性评价方法，有望在药物发现研究中得到广泛应用。