由特聘助理教授黄文教、佐久间真也副教授、鸟取直友助理教授、九州大学工学研究科教授山西洋子和米乐m6官方网站生物过程研究部高级研究员菅野繁雄组成的研究小组，通过控制电场诱导的气泡并对细胞施加机械刺激，能够有效地对细胞膜进行穿孔。几兆道尔顿注3)进入细胞。
细胞膜穿孔技术不仅可以可视化细胞内表达的生物分子的活性，还可以实现基因操作。然而，将能够携带大量基因组信息的大分子引入细胞中是很困难的。在这项研究中，通过回顾这项技术，我们证明了可以通过使用由覆盖介电材料的微电极组成的核壳微泡注射器（见下图）进行机电穿孔在细胞中产生穿孔，将含有大量基因组信息的大分子引入细胞中。通过向电极施加脉冲电压，电极尖端会产生微泡，从而可以同时对细胞施加电刺激和机械刺激。通过使用这种独特的方法，我们可以将数兆道尔顿的分子引入通常难以将分子引入的成骨细胞和衣藻细胞中。特别是，我们发现增加细胞悬浮液的粘度（下图B）可以提高引入效率，这推测是通过电场诱导的气泡的反复膨胀和收缩（振动波）来实现的（下图）。由于它可以应用于多种类型的细胞，因此有望在基因工程方面有许多新的应用。
这项研究于2022年10月20日（日本时间）发表在《英国皇家化学学会科学杂志》上。芯片实验室
研究结果示意图
(A) 气泡喷射器。 (B) 机电穿孔的概念图。低浓度或高浓度的细胞悬浮液同时暴露于电场和机械刺激。当浓度较低时，认为对细胞的机械刺激较小。另一方面，在高度浓缩的悬浮液中，细胞聚集在气泡周围，并暴露于微泡的持续振动下，促进膜穿孔。
近年来，将大分子和长链DNA引入活细胞备受关注。细胞膜穿孔技术不仅可以可视化细胞内表达的生物分子的活性，还可以实现基因操作。例如，作为典型的钻孔技术电穿孔注4)使得将蛋白质、核酸等引入细胞并进行基因操作成为可能。最强大的基因编辑工具CRISPR-Cas系统注5)进入细胞后，可以操纵细胞内基因组中的任何目标基因。一般来说，CRISPR-Cas 系统很大表达向量注6)（>10 kbp）。通过将大分子引入细胞，可以实现更先进的基因操作，从而提高基因改造的效率。然而，尽管常规电穿孔可用于产生1-100 nm范围内的膜孔，但是否可以将携带大量基因组信息的大分子引入各种细胞类型中尚不清楚。
在这项研究中，我们开发了一种基因转移技术，使用具有核壳结构的微泡注射器，该结构由覆盖有电介质的微电极组成。通过使用这种气泡注射器，可以对细胞施加两种类型的物理刺激（电刺激和机械刺激）。当向装置施加脉冲电压以产生气泡时，气泡注射器的尖端处会产生与电穿孔中使用的电场相当的电场（数MV/m），并且该电场预计会导致细胞膜的穿孔。此外，由于施加电压时产生的气泡的振动和破裂，对细胞施加机械刺激。因此，该研究小组致力于建立机电穿孔，认为通过同时对细胞施加电场刺激和使用气泡的机械刺激，可以实现比包括电穿孔在内的以前的导入方法具有更高导入效率的穿孔技术。
在这项研究中，通过增加细胞悬浮液的粘度，我们能够反复膨胀和收缩微泡，从而提高基因导入细胞的效率。图1显示了所构建的机电穿孔实验平台。当在插入含有目标分子的细胞悬浮液的气泡注射器和对电极之间施加脉冲电压时，电场会集中在气泡注射器的尖端，从而在悬浮液中产生微气泡（图1）。此时，根据细胞悬浮液的粘度，气泡周围的流体表现出两种类型的行为，这种流体行为改变了对悬浮液中细胞的机械刺激程度（研究结果示意图）。对于低粘度悬浮液，产生的气泡从装置的尖端顺序注入，从而在容器（微管）内形成循环流。此时，随着细胞沿流动运动，它们受到的机械刺激相对较小，主要是流体剪切力。另一方面，对于高粘度悬浮液，气泡在注射器尖端反复膨胀和收缩。这可能是因为细胞悬液的粘度越高，拖曳力就越大，阻碍了微泡的释放。在这项研究中，我们通过增加细胞和增稠剂的浓度来增加悬浮液的粘度，并通过悬浮液传播气泡振动，我们能够通过压力振动对细胞施加相对较大的机械刺激。
在证明所提出的基因转移方法的有效性之前，我们优化了电源的输出功率。 21×105细胞/μL的NIH/3T3细胞悬浮液（分子导入实验中使用7μL），将输出功率从4W改变到15W，并比较通过机电穿孔导入质粒（pEGFP-N1，导入时使细胞表现出荧光）的效率。我们发现，将功率增加到12 W会增加转染细胞的数量，而进一步将功率增加到15 W会减少转染细胞的数量。 12 W 时，细胞活力约为 60%。另一方面，在 15 W 时，细胞活力下降至约 25%。此外，当我们在 12 W 下检查质粒的状态时，没有发生重大损坏。基于这些结果，12W输出功率被认为对于细胞基因转移最有效，我们在后续实验中应用12W输出功率。
接下来，我们进行了一项实验来研究增加粘度是否可以有效增强机械刺激。对不同细胞浓度的悬浮液粘度进行评估的结果发现，剪切粘度随着细胞浓度的增加而增加（图2）。接下来，我们观察了不同浓度下微泡的行为，发现在低细胞浓度下，产生的气泡引起循环流，而在高细胞浓度下，气泡在装置尖端振动，并且没有发生循环流。这些结果表明粘度影响气泡行为，并证明分子引入的机械刺激可以通过改变溶剂条件来调节。在高细胞浓度下，与低细胞浓度相比，转染的细胞数量更多（图2），这些结果证明了机械刺激和电穿孔相结合对转导效率的影响，验证了机电穿孔的概念。此外，对由于添加增稠剂而引起的粘度变化进行了评估，结果发现细胞悬浮液的粘度在所有情况下均增加，并且通过将增稠剂施用到低细胞浓度的悬浮液中，可以提高基因转移效率（图4）。有人提出，悬浮液的粘度是提高使用微泡将基因引入细胞的效率的重要因素。
我们将开发的机电穿孔技术应用于各种类型的细胞。具体来说，大鼠骨肉瘤细胞系（UMR-106 细胞）和微藻（衣藻，莱茵衣藻）进行了实验。首先，我们制备不同细胞浓度或添加增稠剂的UMR-106细胞悬液，并评估细胞悬液的粘度。如图4所示，证实UMR-106细胞的细胞浓度高时，粘度比低时高，高浓度悬浮液（21×105 细胞/μL），观察到气泡在装置尖端振动。转染实验的结果是，高粘度细胞悬浮液比低浓度细胞悬浮液具有更高的转染效率（图 4(B)）。衣藻是另一种微藻，被认为是未来可再生生物燃料的来源，但其厚厚的细胞壁使其难以进行基因操纵。作为大分子的一个例子，我们旨在将 2000-kDa FITC-葡聚糖引入衣藻中。在与2000-kDa FITC-葡聚糖分子混合并静置的样品中，几乎没有观察到发出绿色荧光的细胞，证实即使对低浓度悬浮液进行气泡处理，也只有少量被引入到细胞中。另一方面，当使用高浓度悬浮液时，证实了在气泡处理过程中FITC-葡聚糖的引入显着增加（图4C）。这样，该系统可用于将聚合物引入具有细胞壁的细胞中，并且我们发现即使在植物细胞中，样品的粘度也是基因引入的重要参数。上述结果证实可以通过机电穿孔将基因导入各种细胞类型中。
图 1
系统配置和气泡发生。红色箭头：细胞引入单元的放大视图。用于质粒导入的系统配置：电源、两个显微操作器、气泡注射器。
图 2
细胞浓度对质粒导入效率的影响。
(A)（左）微管中从低浓度到高浓度的细胞悬浮液图像。 （右）用流变仪测量细胞悬浮液的粘度。
(B) 用不同细胞浓度的质粒转染的 NIH/3T3 细胞的图像（转染后 24 小时）。
(C) 不同细胞浓度下用质粒转染的NIH/3T3细胞的转染效率。 *：p < 005 对比 36×104细胞/μL。
图 3
增稠剂对质粒导入 NIH/3T3 细胞的影响。
(A) 增稠剂浓度与粘度之间的关系。 LCNF：增稠剂长纤维素纳米纤维。
(B) NIH/3T3 细胞图像，显示施用不同浓度增稠剂和引入质粒的效果。细胞浓度：低细胞浓度。
图 4
细胞浓度或添加增稠剂对 UMR-106 以及引入衣藻的影响。
(A) UMR-106 细胞或衣藻粘度的测量。
UMR-低/高：低浓度和高浓度 UMR-106 细胞悬浮液。
衣藻-低/高：低浓度和高浓度衣藻细胞悬液。
(B) 细胞浓度或增稠剂添加对 UMR-106 细胞转染的影响。
(C) 在低/高细胞浓度下引入衣藻。 FITC：2000 kDa FITC 标记的葡聚糖。
标题：用于转染分子的细胞粘度辅助机电穿孔
作者：Wenjing Huang、Shinya Sakuma、Naotomo Tottori、Shigeo S Sugano 和 Yoko Yamanishi
已出版的杂志：芯片实验室
DOI：101039/d2lc00628f
这项研究得到了 JST 战略创意研究促进项目（CREST、JPMJCR19S6）的支持。