- 鉴定出与药物代谢酶活性相关的拉曼光谱信号
- 不破坏细胞，只是用光照射它们药物代谢酶 (CYP)活动的成功可视化
- 为再生医学中使用的细胞产品的药物开发和质量控制中的副作用评估做出贡献
肝细胞（肝细胞）8297_8321
诱导 CYP 表达的药物 (利福平)添加量（0至4μM）的增加，肝细胞中的CYP活性增加。
(*红色：细胞色素c，绿色：CYP 活动）
8576_8813拉曼散射检测来估计。基于这些知识，我们成功地使用拉曼散射显微镜可视化 CYP 酶活性的细胞内分布，而无需破坏活的、未标记的细胞，只需将它们暴露在光下即可。我们还证明，通过同时检测其他生物分子的拉曼散射，我们可以从多个角度分析细胞对药物的反应。该技术有望应用于药物发现和开发中的肝脏药物反应测试以及再生医学中使用的肝细胞产品的质量评价。
该技术的详细信息将于 2022 年 8 月 22 日（英国夏令时间）公布。通讯生物学发布
药物代谢酶（CYP）主要用于肝细胞和小肠上皮细胞并参与所施用药物的代谢。药物对 CYP 活性的诱导或抑制通常是意想不到的药物不良反应（ADR）仅靠计算机很难对药物代谢进行定量评估，因此还使用肝细胞和动物模型进行药物反应测试。此外，CYP 活性的评估是肝脏的重要功能，对于预期用于再生医学的细胞产品（例如肝细胞）的质量控制至关重要。
目前CYP活性评价采用荧光法、发光法等端点测量和质谱法，很难测量亚细胞分布和活性时间过程，这阻碍了研究和产品开发。
AIST 与大阪大学签订了一份关于建立和运营研究中心的谅解备忘录，该研究中心用于研究和开发下一代生物传感系统，该系统实施光子学分析和测量各种生物分子的先进基础技术。从 2017 年 1 月 6 日起，AIST-大阪大学先进光子学和生物传感开放创新实验室将在大阪大学吹田校区成立。我们正在“一站式”系统下进行联合研发。第二阶段计划将于2022年1月6日开始，我们将针对创新诊断设备、药物发现/再生医学工具和健康监测技术进行社会示范/实施研究，目标是“实现一个人们可以享受生活而不用担心健康的医疗保健社会。”
在这项研究中，发展目标之一是“开发无需标记即可获取细胞/组织分子信息的技术及其在医疗设备中的应用。”线扫描使用这种显微镜，我们正在开发以微创和非破坏性方式可视化肝细胞分子的技术，并了解肝细胞的质量和状况。在此过程中，我们发现肝细胞中表达的药物代谢酶（CYP）的酶活性与氧化CYP的分子数量之间存在相关性。利用这一发现，我们开发了一种利用拉曼散射检测细胞内氧化 CYP 酶并测量 CYP 酶活性的技术。 CYP在肝细胞内药物和毒物的代谢中发挥着重要作用，由于拉曼散射可以同时检测CYP活性和其他生物分子，因此所开发的技术使得从多个角度分析细胞对药物的反应成为可能。
请注意，这项研究和开发是由日本科学技术振兴机构“研究成果部署项目共创空间形成支持计划（共创领域/培育型/全面型）（FY2020-2021/FY2022-2031）（JPMJPF2009）”和“战略创意研究促进”委托的项目项目”。由 CREST (2019-2024) (JPMJCR1925) 支持。
10865_11096HepaRG)和不添加利福平的“对照”肝细胞。 1370 cm-1和 1636 厘米-1的信号增加。图 1b 是通过使用图 1a 中的光谱构建每个波数的细胞图像而创建的拉曼散射图像。 CYP（1370 厘米-1和 1636 厘米-1) 对氧化 CYP 的拉曼信号进行成像。不含利福平的对照肝细胞图像显示 1370 cm 处氧化 CYP 的分子数-1和 1636 厘米-1的信号被观察到。另一方面，添加利福平后，1370 cm-1和 1636 厘米-1的信号细胞内不断增加。图 1c、d 和 e 分别在 CYP 中表达最频繁CYP3A4免疫染色，CYP3A4 活性，CYP3A4蛋白质印迹1370 cm-1和 1636 厘米-1的拉曼信号存在相关性。
图1：通过添加利福平诱导肝细胞(HepaRG)中的CYP表达
图中的“诱导”是指加入利福平诱导CYP表达的细胞，“对照”是指未加入利福平的细胞。 a “诱导”和“对照”肝细胞的拉曼光谱比较。右上角的两个插图是 1370 厘米-1和 1636 厘米-1附近的光谱放大图b使用细胞内分子成像比较“诱导”和“对照”肝细胞。细胞色素c（600 厘米-1) 是细胞色素c，细胞色素b5（675 厘米-1) 是细胞色素b5，苯基。 （1000 厘米-1) 是苯丙氨酸，CYP (1370 cm-1和 1636 厘米-1) 对氧化 CYP 的拉曼信号进行成像。 c “诱导”肝细胞和“对照”肝细胞的免疫染色图像的比较。从左到右：细胞核（Nuclei）用蓝色荧光物质（DAPI）染色，细胞内细胞色素用红色荧光物质（Alexa 594）染色b5（细胞色素b5)显示用绿色荧光物质(Alexa 488)染色的细胞内CYP3A4，右边缘是左侧三幅图像的合成图像(Merge)。 d使用化学发光测定比较“诱导”和“对照”肝细胞中的 CYP3A4 活性。 e “诱导”和“对照”肝细胞中蛋白质表达水平的比较。从肝细胞中获取细胞提取物并检测CYP3A4、细胞色素c（细胞色素c)，细胞色素b5（细胞色素b5)和β-肌动蛋白蛋白量进行定量。
以上结果仅表明氧化的CYP 1370 cm的分子数-1和 1636 厘米-1与CYP分子总数或CYP活性相关，我们进行了以下实验来证实这一点。基于机制的抑制剂 (MBI)是Azamulin已知可使 CYP3A 酶组失活，包括 CYP3A4。失活的 CYP3A4 分子保留在细胞内，因此 CYP3A4 分子的数量预计将保持不变。图2a是添加或不添加azamulin的肝细胞(HepaRG)的拉曼散射图像，其中针对每个波数构建了细胞图像。如图所示CYP（1370厘米-1和 1636 厘米-1) 对氧化 CYP 的拉曼信号进行成像。添加azamulin后为1370 cm-1和 1636 厘米-1的信号强度已减少。另一方面，当我们进行免疫染色来测量 CYP 分子的数量时，我们几乎无法确认 CYP3A4 的减少，而 CYP3A4 占所有 CYP 的大部分（图 2b）。该结果表明氧化的 CYP 1370 cm-1和 1636 厘米-1的信号强度与CYP分子总数无关，但与CYP活性相关。
图2：添加azamulin 抑制肝细胞(HepaRG) 中的CYP3A4 活性
a。添加和不添加azamulin 的肝细胞(HepaRG) 拉曼光谱的比较。细胞色素c（600 厘米-1) 是细胞色素c，细胞色素b5（675 厘米-1) 是细胞色素b5，CYP（1370 厘米-1和 1636 厘米-1) 对氧化 CYP 的拉曼信号进行成像。 b添加和不添加azamulin 的肝细胞免疫染色图像的比较。免疫染色细胞内细胞色素用红色荧光物质染色（Alexa 594）b5细胞内CYP3A4用绿色荧光物质(Alexa 488)染色。
CYP在肝细胞内药物和毒物的代谢中起着重要作用，因此拉曼信号与CYP活性相关（1636 cm-1) 和糖原 (940 cm-1)，苯丙氨酸 (1000 cm-1)，脂质(1450 cm-1)（图3）。在细胞中，苯丙氨酸信号已知与细胞蛋白质含量相关。当培养肝细胞（HepaRG）7天以促进肝细胞成熟并添加诱导CYP的利福平进行比较时，发现糖原信号与CYP信号呈负相关。该结果表明CYP活化和通过糖原分解的糖异生可能密切相关。
图3：使用细胞内分子成像比较添加/不添加利福平（RIF）对培养7天的肝细胞（HepaRG）的影响
D0是培养第0天的肝细胞，D7是培养第7天，D7 RIF是在第5天添加利福平诱导CYP后培养第7天的肝细胞。在每个培养日，明场图像（Brightfield），细胞色素b5（675 厘米-1、细胞色素b5)，糖原(940 cm-1，糖原），氧化 CYP/CYP 活性（1636 cm-1，CYP)，细胞色素c（600厘米-1，细胞色素c)，苯丙氨酸 (1000 cm-1，苯基。），脂质（1450 cm-1，脂质）。
这些结果表明，只需将未标记的细胞和组织暴露在光下，就可以无损地获取生物分子信息，并了解细胞和组织的状态。此外，与传统方法不同，由于可以测量每个细胞中代谢分子的量和 CYP 活性，因此可以测量异质细胞群中的单个细胞反应。该技术可应用于药物发现和开发中肝细胞的质量控制和肝脏代谢评价。
*本新闻稿中的“摘要图、图1、图2、图3”是对原始论文“图3、图1、图4、图5”的引用或修改。
未来，我们计划利用这项研究成果，建立一种测量肝脏分化和成熟状态的技术作为分析软件，并进行研究和开发，旨在将其作为利用拉曼光谱进行肝细胞质量控制和药物开发的医疗支持设备在社会上实施。此外，拉曼光谱和拉曼显微镜技术可以通过应用光以无标记和无损的方式获取细胞和组织中生物分子的信息，因此我们相信它们可以用作各种医疗支持技术，例如根据生物信息诊断疾病、诊断癌细胞是否存在以及控制再生医学产品的质量。我们将致力于其他器官和细胞的疾病诊断和细胞质量控制技术的开发，目标是“实现一个让人们无需担心健康而享受生活的医疗保健社会”。
已出版的杂志：通讯生物学
论文标题：通过拉曼显微镜对细胞色素 P450 活性进行无标记化学成像
作者：Menglu Li、Yasunori Nawa、Seiichi Ishida、Yasunari Kanda、Satoshi Fujita*、Katsumasa Fujita*
DOI：101038/s42003-022-03713-1