米乐m6官方网站（以下简称“AIST”）生物过程研究部生物共生进化机制研究组古河龙一研究组组长、森山稔首席研究员、深津竹间首席研究员、ERATO深津共生进化机制项目研究导师：东京大学研究生院理学研究科Tsutomu Furusawa教授，国立大学法人与艺术科学研究生院若本雄一教授合作，共生细菌没有就活不下去德国臭虫中的共生细菌并替换它快速进化的大肠杆菌并在实验室中不断繁殖和维护，全局转录控制系统单一突变大肠杆菌支持宿主臭虫的生存必需的共生细菌
这项研究表明，宿主生存所必需的共生微生物的进化比以前想象的更快、更容易。我们能够将分子生物学中研究最多的模型细菌大肠杆菌进化为共生细菌，这是开创性的。这个昆虫-E。大肠杆菌实验共生进化系统，预计我们对共生进化过程和机制的理解将在未来取得巨大进展。
这项研究成果将于2022年8月4日（英国夏令时间）发表在国际学术期刊《自然微生物学
共生进化前后的大肠杆菌以及感染它们的成年德国绿蝽
进化前，大肠杆菌体形较长，感染昆虫的出现率较低，身体较小，呈棕色（左），但进化后，大肠杆菌较短，感染昆虫的出现率提高，身体较大，呈绿色（右）。
对植物、动物（包括人类）和微生物之间共生关系的研究正在国际范围内扩大，但几乎所有先前的研究都集中在现有的高级共生关系上。然而，即使是高度专业化的共生微生物最初也一定是自由生活的。共生关系如何开始和建立，特别是对于宿主生物体的生存至关重要的高级类型。互利共生这种关系的进化起源仍然是一个悬而未决的基本问题。然而，由于这是一个发生在遥远过去的进化事件，实证研究被认为是困难的。
另一方面，近年来，人们致力于在实验室中实时阐明进化过程和机制，主要针对微生物。实验进化'' 正在积极举行。这是重现和理解进化过程的努力，例如抗生素耐药性、高温耐受性、宿主感染性以及致病性的减少/增强。然而，人们普遍认为在实验室中进化出高度互利的微生物是困难的，而这些微生物对于宿主生物的生存至关重要，而且之前还没有此类研究。
AIST 的生物过程研究部门正在开展以昆虫为重点的研究，昆虫是陆地生态系统生物多样性的主要驱动力，以及在昆虫体内共存并发挥高级生物功能的微生物。关于作为农业害虫尤为重要的臭虫肠道共生菌，请参考《发现由共生细菌引起的害虫” （AIST 新闻稿，2007 年 6 月 13 日），“发现使昆虫对杀虫剂产生抗药性的共生细菌” （2012 年 4 月 24 日，AIST 新闻稿），“聚酯在昆虫与细菌共生中的新功能” （AIST 新闻稿，2013 年 6 月 11 日）。特别是，“从环境细菌进化而来的共生细菌''（2016年1月11日，AIST新闻稿），我们阐明了德国绿蝽日本种群肠道共生菌的多样性，并进行了各种共生菌去除和再感染实验。在此过程中，他们尝试使用包括大肠杆菌在内的非共生细菌进行感染实验，从而促成了当前研究成果的发展。
这项研究和开发得到了日本科学技术振兴机构的“ERATO Fukatsu 共生进化机制项目（2019-2024）”的支持。
德国绿蝽消化道的后部（图1A）是特化的共生器官（图1B）和共生细菌（肠杆菌科泛菌属)（图1C）。这种共生细菌对于幼虫的生长至关重要。当母虫产卵时，它会在卵表面涂上共生细菌，孵化的幼虫通过吮吸卵表面来获得共生细菌（图1D）。感染共生菌的幼虫发育正常，在饲养条件下，大约80%通常会羽化并变成绿色成虫（图1A）。另一方面，当通过对卵表面进行消毒来实验创造出未被共生细菌感染的幼虫时，幼虫的生长明显延迟，并且大多数幼虫没有成为成虫就死亡。
当让表面已消毒的卵孵化出的不育幼虫吸食悬浮有大肠杆菌的水时，生长明显延迟，但少数（约 5% 至 10%）长成小成虫，体色异常呈棕色（图 2A）。虽然共生器官是无色且未发育的（图2B），FISH 方法确认时，内部感染了大肠杆菌，并且定位与共生菌相似（图2C）。其中一些成虫交配并产下少量卵，卵表面涂有大肠杆菌（图2D），孵化的幼虫通过吮吸卵表面获得大肠杆菌。
图1 感染共生菌的正常德国绿蝽
(A) 正常成人。出苗率80%左右，颜色绿色。 (B) 提取的胃肠道。后端发育出黄色共生器官。 (C) 通过 FISH 方法检测共生细菌。定位于共生器官。 (D) 通过吸取施加到卵表面的共生细菌来孵化幼虫。
图2 德国绿蝽清除了共生细菌并感染了大肠杆菌
(A) 出现的成人。多数在幼虫期死亡，羽化率在5-10%左右，体型变小，体色呈现异常的棕色。 (B) 提取的胃肠道。后端的共生器官无色、薄、不发达。 (C) FISH 法检测大肠杆菌。与共生细菌一样，它位于共生器官中。 (D) 应用于鸡蛋表面的大肠杆菌的荧光显微镜图像。
大肠杆菌最初是一种主要生活在人类等哺乳动物肠道中的细菌，最初不应与臭虫有关。尽管如此，人们发现，虽然不完美，但它具有与臭虫共存并支持其生存的最低能力。难道不可能用这样的大肠杆菌感染臭虫，并通过不断种植它们，像共生细菌一样进化吗？
我们设计了一种实验进化方法，将大肠杆菌进化为臭虫的共生细菌。然而，很难指望仅仅通过用大肠杆菌感染臭虫并圈养它们，就能在大肠杆菌中轻易地发生共生进化。因此，我们决定使用快速进化的大肠杆菌。DNA 错配修复基因 mutS已删除突变率增加约100倍，分子进化速度加速约100倍。各种特性的进化速度预计将相应加快。通过饲养和维持摄入这种快速进化的大肠杆菌的无菌臭虫幼虫，我们创建了一个实验进化系列，其中选择应用于生长速度（去除最早出现的成虫的共生器官，并将其中的大肠杆菌接种到下一代/冷冻保存），并选择实验进化系列的体色（去除最绿色的成虫的共生器官，并将其中的大肠杆菌接种到下一代）生成/冷冻保存）（图3）。作为比较的目标区域，针对感染野生型大肠杆菌的臭虫创建了进化系列，其进化速度并未加快。
图3 共生进化实验设计
我们创建了12个体色选择进化品系的11个目标品系和7个生长速度选择品系的7个目标品系，并在大约2年的时间里维持了10代以上寄主臭虫的繁殖。结果，在体色选择性进化系的1个系(CmL05)中，从第7代(约1年零2个月后)开始，在生长速度选择系的1个系(GmL07)中，从第2代(约2个月后)起，出苗率(30-80％)显着增加。在这些进化系中，随着羽化率的增加，椿象的体型也随之增大，体色也趋向于接近正常的绿色（图4，顶行）。这样的大肠杆菌含有刚果红的琼脂培养基培养时，共生进化前，形成红色大菌落，共生进化后，形成白色小菌落，细胞外基质显着减少（图 4，底行）。
图4 感染共生进化大肠杆菌的宿主德国绿蝽的外观及共生进化大肠杆菌的菌落形状
观察到宿主椿象的体型增大、变绿，以及大肠杆菌菌落的细胞外基质产量减少。
此外，当我们在液体培养基中培养这些大肠杆菌并检查各种特性时，我们发现生长速率下降（图 5A），细胞尺寸减小（图 5B），鞭毛运动（图 5C）、细胞形态不稳定（图 5D）以及宿主内感染密度增加。
图5 共生进化 大肠杆菌共生进化前后的变化
独立的进化谱系（CmL05、GmL07）、(A) 生长速率降低（12 小时液体培养中细菌质量的增加速率）、(B) 细胞大小减小（细菌的相差显微图像）、(C) 鞭毛运动丧失（细菌运动轨迹彩虹图 5 秒）、(D) 细胞形态不稳定（最初为芽孢杆菌，但表现出球菌样形态和显着的小型化）。
共生和未共生进化的大肠杆菌菌株的基因表达RNAseq方法的全面调查揭示了共生进化前后基因表达模式以特定方式发生显着变化。此外，对于大肠杆菌的两个进化谱系，我们分析了每一代宿主的大肠杆菌的整个基因组序列。下一代测序仪，在共生进化出现的基因组上进行确定和比较功能丧失突变。结果，作为候选致病基因，在体色选择进化系CmL05腺苷酸环化酶基因 (cyaA)但在增长率选择进化系列GmL07cAMP 受体蛋白基因 (crp)被识别出来。这些基因使大肠杆菌和其他细菌能够检测周围碳源（通常主要是葡萄糖）的消耗，并彻底改变基因表达模式以利用其他碳源（例如半乳糖、麦芽糖等）。碳分解代谢物抑制''是全局转录控制系统的重要组成部分。
为了确认这些基因是否负责大肠杆菌共生进化，我们创建了仅在野生型大肠杆菌的 cyaA 基因和 crp 基因中引入类似突变的菌株。菌落变得更小、更白，再现了细胞尺寸的减小和鞭毛运动的丧失。此外，当被不育的臭虫幼虫摄入时，出现了提高的羽化率、增大的体型和绿色的体色（图6）。换句话说，研究表明，大肠杆菌成为一种重要的共生细菌，通过产生单个突变来支持臭虫的生存，该突变使碳分解代谢物抑制失效，并防止代谢转换，即使在葡萄糖饥饿下也是如此。
图 6 通过向野生型大肠杆菌中引入突变来证明负责共生进化的基因
当被宿主椿象的不育幼虫摄入时，观察到与感染共生进化大肠杆菌的宿主椿象相同的表型，包括高羽化率、体型增大和绿色体色。
这些结果表明，只需大肠杆菌基因组中的一个突变，它就可以稳定地维持在德国绿蝽的共生器官中，并成为支持其生存和繁殖的重要共生细菌。此前人们认为，对于宿主生物体的生存至关重要的共生细菌的进化不会那么容易发生，但这项研究的结果推翻了传统观点，表明共生进化有可能快速、轻松地发生。常见细菌大肠杆菌可以如此轻易地进化成互利共生细菌的发现令人惊讶。另一方面，在自然界中，各种各样的昆虫和其他生物与各种微生物形成互利共生的关系。与微生物的互利关系是普遍且多样的，这一事实可能反映出建立共生进化的障碍并不意外地高。这是一个有影响力的发现，促使我们重新考虑我们传统的进化论观点。大肠杆菌是研究最多的模式生物之一，拥有丰富的复杂生物信息、遗传资源和分子生物学技术。通过利用本研究建立的昆虫-大肠杆菌实验共生进化系统，预计未来我们对共生进化过程和机制的理解将取得巨大进展。
大肠杆菌因碳分解代谢物抑制系统不再发挥作用的突变而成为共生菌的具体机制是未来研究的主题。例如，crp 基因的产物（本研究中确定的致病基因之一）与 cAMP 结合并充当广泛的转录调节因子，通过增加或减少数百个基因的表达来引起代谢转换。在这些众多的下游基因中，我们将通过将大肠杆菌突变体文库摄入不育的椿象幼虫中进行筛选等方法，探索哪些基因参与了共生细菌的发育。
预计还有各种其他基因参与大肠杆菌向共生细菌的转化。我们已经获得了多个共生进化的大肠杆菌菌株，可以显着提高臭虫的出现率，但不会引起菌落形状的变化，我们将继续分析它们的功能，并继续更大规模的昆虫-大肠杆菌共生进化实验。
大肠杆菌最初是人类和小鼠等哺乳动物的肠道细菌。近年来，它是通过将大肠杆菌摄入无菌小鼠体内而产生的知生小鼠进行实验进化研究也在积极进行。我们已经开始了一项结合昆虫E的进化实验。大肠杆菌实验共生进化系统和小鼠-E。大肠杆菌实验共生进化系统，并计划利用这种方法探索无脊椎动物和脊椎动物肠道共生机制的差异和共性。
已出版的杂志：自然微生物学
论文标题：单一突变使得大肠杆菌昆虫互利共生
作者：Ryuichi Koga、Minoru Moriyama、Naoko Onodera-Tanifuji、Yoshiko Ishii、Hiroki Takai、Masaki Mizutani、Kohei Oguchi、Reiko Okura、Shingo Suzuki、Yasuhiro Goto、Tetsuya Hayashi、Masahide Seki、Yutaka Suzuki、Yudai Nishide、Takahiro Hosokawa、若本雄一、古泽力、深津武间
DOI：101038/s41564-022-01179-9