由名古屋大学医学研究生院和高等研究所的 Katsura Zaitsu 副教授、研究生 Daisuke Kawakami 和国家先进工业技术研究所地质信息研究部首席科学家 Ryo Iguchi 领导的研究小组是老鼠的大脑微透析法（脑微透析法）1和尖端电喷雾电离串联质谱法 (PESI/MS/MS)2结合鼠标自由移动下神经递质3浓度的变化每分钟。另外，单鼠标时间序列数据4到使用贝叶斯统计建模的状态空间模型5，我们证明可以分析单只小鼠的神经递质行为。
PESI/MS/MS是我们课题组在2016年开发的，不需要预处理操作，可以将所需的样品量减少到几μL。另一方面，微透析法是收集脑内神经递质的经典方法，是一种使灌注液（用于清洗器官等的液体）以低流速流过植入脑内的透析膜，并定期收集灌注液以观察神经递质浓度变化的方法。这次，研究小组开发了一种技术，通过将PESI/MS/MS与微透析相结合，分析每分钟收集的灌流液，可以观察每分钟脑部神经递质谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）浓度的变化。为了评价该技术的实用性，钾离子诱导去极化6纹状体7中谷氨酸和GABA的行为。通过将使用贝叶斯统计模型的状态空间模型应用于从单个小鼠获得的时间序列数据，我们发现可以在不使用传统统计分析方法的情况下仅分析一只小鼠大脑中神经递质的行为。
未来，如果将此方法应用于阿尔茨海默病模型小鼠和帕金森病模型小鼠，将有可能更详细地分析每种疾病状态下脑神经递质的行为，并且强烈期望这将导致新病理机制的阐明和治疗药物反应性的评估。
该研究成果是基于名古屋大学研究强化促进项目、Young New Field Creation Research Unit Frontier（体内实时组学实验室，代表研究员：Katsura Zaitsu）和米乐m6官方网站的共同研究成果，并于 2021 年 6 月 30 日发表在《International Journal of Analytical Chemistry》上。塔兰塔''将以网络版发布。
这项研究是在日本学术振兴会、科学研究补助金、科学研究补助金（S）“新生儿大脑的神经发生及其病理生理学：利用先进分析技术的综合理解”（代表研究员：泽本和信）和科学研究（B）“活体小鼠大脑时空代谢组分析方法的开发和实证评估”的支持下进行的使用实时质谱分析”（代表研究员：Katsura Zaitsu）。
神经递质负责在神经细胞之间传递信息，代表性例子包括兴奋性谷氨酸和抑制性 γ-氨基丁酸 (GABA)。大脑通过巧妙地调节兴奋性和抑制性神经传递来维持记忆和学习等高级大脑功能，观察谷氨酸和GABA等神经递质的行为对于阐明大脑病理学也很重要。
观察小鼠大脑中神经递质行为的经典方法是微透析法，该方法包括通过手术将微透析膜植入大脑并回收神经递质。在微透析方法中，通过以几μL/分钟的低流速从外部流动灌注液来回收已进入植入大脑的微透析膜内部的神经递质。为了测量收集的灌注液中的神经递质，传统上液相色谱和液相色谱质谱8等，但为了确保测定所需的样品量，需要收集15～20分钟的灌注液。换句话说，使用上述分析方法的局限性在于，只能以15至20分钟的间隔观察大脑中神经递质的行为。另外，为了进行质谱分析，需要花费时间对灌流液进行脱盐，使得操作变得复杂。
另一方面，为了利用微透析方法统计分析大脑中神经递质的行为，使用多只小鼠进行了实验，并对这些小鼠在每个观察时间点的神经递质浓度进行平均，并计算时间点之间的数据统计分析（显着性检验）9然而，原本通过微透析从单只小鼠身上获得的神经递质浓度变化是“时间序列数据”，前后数据之间存在差异。自相关10因此，如果我们对从多只小鼠获得的时间序列数据进行平均，则每只小鼠的时间序列数据的趋势将被抵消，因此我们需要开发更合适的分析方法。
Zaitsu副教授课题组于2016年开发出探针电喷雾电离串联质谱法（PESI/MS/MS）（图1），目前已实现微小脑区域的直接分析和微小样本的分析。 （K Zaitsu* 等人，分析化学 2016；Y Hayashi、K Zaitsu* 等人，Analytica Chimica Acta 2017；K Zaitsu* 等人，分析化学 2018；K Zaitsu* 等人，分析化学 2020；K Hisatsune、K Zaitsu* 等人，ACS Omega 2020。）该方法使用超细针对目标成分进行采样和电离，因此不需要预处理，只需几μL的样品量即可进行分析。
因此，我们研究了微透析获得的灌流液是否可以通过 PESI/MS/MS 进行分析。将谷氨酸和 GABA 添加到用作灌注液的人工脑脊液 (aCSF) 中，并使用 PESI/MS/MS 进行分析。经过对条件的考察，我们按照图 2 所示的操作流程构建了定量分析方法（图 2）。
每个样品的分析时间仅为 30 秒，谷氨酸和 GABA 的校准曲线均显示出良好的线性。还表明，日内和日间定量准确度和重现性较高。特别是，该方法仅使用 3 µL aCSF 即可快速测量谷氨酸和 GABA 浓度。这意味着，如果将微透析用灌流液的流速设定为3μL/min，则只需每分钟收集一次灌流液，每分钟即可观察到脑内谷氨酸和GABA浓度的变化。
图 1 PESI/MS/MS 的外观
图2 定量分析操作流程IS：内标物质。
12599_12711+通过灌注液体去极化）8时谷氨酸和GABA浓度发生变化。这里，将灌流液的流速设置为3μL/min，并且每5分钟或每1分钟收集一次灌流液进行测量。结果如图 3 和 4 所示。
如图 3 和图 4 所示，每 5 分钟收集的数据和每 1 分钟收集的数据均具有 High-K+将灌注液切换为12929_13026|12929_13026|后立即观察到谷氨酸浓度增加我们还观察到 GABA 浓度的增加略晚于谷氨酸浓度的增加。
因此，为了分析每只小鼠的这些时间序列数据，我们应用了基于贝叶斯统计模型的状态空间模型。在这里，我们使用灌注 aCSF 溶液时的稳态浓度，使用状态空间模型计算了 95% 置信区间（图 3 中的值从 0 到 25 分钟，图 4 中的值从 0 到 9 分钟）。图 3 和图 4 中的蓝色带分别显示了该 95% 置信区间。
图3所示的5分钟时间序列数据中，High-K+由于液体灌注去极化，谷氨酸和 GABA 值高于 95% 置信区间。然而，如图 3a-1 所示，在一只小鼠中，谷氨酸在 65 分钟时低于 95% 置信区间，而在另一只小鼠中，如图 3b-1 所示，谷氨酸并未低于 95% 置信区间。
另一方面，在图4a-1和4b-1所示的每分钟时间序列数据中，证实在两只小鼠中，谷氨酸由于去极化而显示出高于95%置信区间的值，然后下降至低于该置信区间的值。结果表明，每分钟收集的数据可以更详细地观察大脑中神经递质的行为。
此外，在图 3 和 4 所示的两只小鼠中，高 K+在液体灌注期间，GABA 浓度保持在 95% 置信区间之上。因此，已经表明该方法可以详细观察纹状体中谷氨酸和GABA的摄取机制的差异。
由于上述原因，在这项研究中，我们成功开发了一种方法来观察小鼠自由运动期间每分钟大脑中神经递质的行为。我们还首次成功地将基于贝叶斯统计模型的状态空间模型应用于微透析获得的时间序列数据，并证明了其实用性。
图 3 小鼠纹状体中 L-Glu 和 GABA 每 5 分钟的变化。
每 5 分钟收集一次灌流液并测量谷氨酸（a-1 和 b-1）和 GABA（a-2 和 b-2）浓度的结果。图中黑色下划线部分为High-K+表示溶液作为灌注液流动的时间范围。 *：表示根据状态空间模型计算出的 95% 置信区间之外的值。 #：表示检测下限和定量下限之间的值。
图 4 小鼠纹状体中 L-Glu 和 GABA 的微小变化。
每分钟收集灌注液并测量谷氨酸（a-1 和 b-1）和 GABA（a-2 和 b-2）浓度的结果。图中黑色下划线部分为High-K+表示溶液作为灌注液流动的时间范围。 *：表示根据状态空间模型计算出的 95% 置信区间之外的值。
通过将此方法应用于阿尔茨海默病和帕金森病等疾病模型小鼠的分析，预计将有可能更详细地跟踪神经递质在每种疾病状态下的行为。尤其是有望应用于近年来备受关注的痴呆症治疗开发中的治疗效果和药物反应性评价。
此外，未来，除了扩大测量成分范围，将神经递质以外的成分纳入其中之外，我们的目标是开发一种能够在几秒钟内观察大脑分子变化的技术，使用“体内实时大脑测量系统”，通过使用在线连接微透析和PESI/MS/MS的设备（目前正在申请专利）来实时测量大脑生物分子的变化。
杂志名称：塔兰塔
论文标题：通过 PESI/MS/MS 快速定量小鼠大脑中的细胞外神经递质，并使用基于 R 和 Stan 的贝叶斯状态空间模型进行纵向数据分析
Author: Daisuke Kawakamia，b，土屋光希a，村田佑b，井口晃c，财津庆a、d、*
隶属关系：a名古屋大学医学研究生院法律医学与生物伦理学系，地址：65 Tsurumai-cho, Showa-ku, Nagoya, 466-8550, Japan
b岛津制作所，1, Nishinokyo-Kuwabaracho Nakagyo-ku, 京都市，604-8511，日本
c日本地质调查局、国家先进工业科学技术研究所 (AIST)，茨城县筑波市，邮编 305-8567，日本
d体内实时组学实验室，高级研究所，名古屋大学，Furo-cho，Chikusa-ku，名古屋，464-8601，日本
DOI：