国立先进产业科学技术研究所[主席：石村和彦]（以下简称“AIST”）健康和医学工程研究部[研究主任：Yoshiro Tatsu]分子复杂生理学研究组 Makoto Miyagishi 研究组组长生物医学研究部[研究主任：Yoshiaki Onishi]结构药物发现研究组研究组组长加藤义夫，以及其他研究小组基因组编辑酶Cas9紧密结合的核酸分子并控制酶活性 (核酸适体) 已开发。此外，通过将该核酸适体引入细胞中，可以控制基因组编辑酶的活性，从而抑制过去一直存在的意外基因组编辑（脱靶）问题，并证明可以更准确地进行基因组编辑。该技术有望为分子生物学研究、基因治疗和育种等使用基因组编辑技术的各个领域做出贡献。此外，2020 年 10 月 30 日核酸研究杂志（电子版，开放获取）。
新开发的核酸适体可以抑制意外的基因组编辑
近期，改写基因序列的基因组编辑技术在生物和医药领域引起广泛关注，并荣获2020年诺贝尔化学奖。这项技术利用基因组编辑酶重写（编辑）细胞的基因组序列，目前正在多种应用中进行研究，包括基因治疗、育种和医疗技术。然而，基因组编辑导致的基因组序列意外突变和缺失（脱靶）的发生是保障安全的一大问题。
AIST 开发了自己的核酸适体获取技术（体外选择方法)，并获得了与各种靶分子结合的核酸适体，包括识别外泌体（细胞外囊泡）的核酸适体。此次，我们针对基因组编辑酶Cas9，采用体外筛选的方法进行筛选，旨在获得兼具高结合能力和抑制活性的核酸适配体。
这项研究和开发得到了新能源和产业技术综合开发机构委托的“利用植物和其他生物的高功能产品生产技术开发项目（2016-2019）”的支持。
针对基因组编辑酶Cas9蛋白，我们利用体外选择方法从核酸文库中选择了与Cas9蛋白结合的核酸序列。我们利用新一代测序仪对Cas9蛋白结合的核酸序列进行了大规模的序列分析和信息分析，发现了多个候选核酸序列。以Cas9酶活性为指标，对这些候选核酸序列进行二次筛选，发现了抑制酶活性的核酸序列（核酸适体）。详细分析表明，该核酸适体与Cas9的基因组DNA结合区域和引导RNA crRNA结合，推测这些结合有助于抑制活性。我们还证实，通过将该核酸适体引入细胞中可以控制细胞内基因组编辑。此外，在该核酸适体的crRNA识别序列中添加修饰核酸(低噪声放大器)，细胞内核酸适体活性显着提高（图1）。
为了评估新开发的核酸适体抑制意外核酸序列突变和缺失的效果，将靶向EMX1基因位点的Cas9/sgRNA质粒引入HEK293细胞，并在10小时和2天后引入使用LNA的核酸适体。 5天后收集细胞，使用下一代测序仪对提取的DNA进行测序，检查EMX1靶位点和报告的脱靶位点的序列变异（indels），并计算抑制效果（抑制率）。研究发现，通过在适当的时机将核酸适体引入细胞，基因组编辑酶Cas9在脱靶位点发生的非特异性基因组编辑可以比靶位点的特异性基因组编辑受到大约25倍的抑制（图2）。通过使用新开发的核酸适体控制基因组编辑酶，我们抑制了脱靶位点基因组编辑的发生，使得进行更准确、更安全的基因组编辑成为可能。
本次开发的核酸适体的设计理念可以应用于Cas9以外的各种CRISPR家族成员（Cas3、Cpf1等），因此有望在目前尚未发现抑制剂的基因组编辑酶相关方面有多种应用。
图1 使用核酸适体的细胞内基因组编辑控制
将核酸适体引入细胞会减少发生基因组编辑的细胞数量（红色）（左）。当使用使用修饰核酸LNA的核酸适体时，几乎所有基因组编辑的细胞都消失了（右）。左图显示，通过将Cas9/crRNA复合物导入HEK293细胞中，插入基因组的表达调控DNA区域发生基因组编辑，并表达下游荧光蛋白，使细胞呈现红色。左上和右下的图像是使用称为细胞分选仪的设备测量单个细胞的特征。横轴表示荧光染料的量，纵轴表示细胞自发荧光的量。
图2 抑制非特异性基因组编辑的效果（脱靶）
我们目前正在分析与 Cas9 其他位点结合的其他核酸适体的结合位点。我们希望开发多种核酸适体，与基因组编辑酶的不同位点结合，并构建控制基因组编辑各种功能的技术。