Yoshi Tanaka，RIKEN 生物系统动力学研究中心综合生物设备研究团队组长，Hidenori Nagai，米乐m6官方网站 (AIST) 生物医学研究所下一代医疗器械研究组研究组组长联合研究小组用于蛋白质白蛋白[1]作为原料硅橡胶[2]制作模具，我们成功地轻松制造了用于细胞培养的微型装置。
这项研究的结果不仅有助于对微器件开发的工程理解，而且有助于通过使用微器件进行细胞培养来理解微环境对细胞的影响以及细胞与细胞粘附基质表面蛋白质之间的相互作用。
这一次，联合研究小组细胞图案化[3]”的装置时，我们研究了各种溶液如何利用真空抽吸流入模具，结果发现流入模具的溶液量并不取决于溶液的粘度，并且可以使用多种溶液。此外，通过使用AIST开发的交联白蛋白水溶液，发现可以在一天之内制作出用于细胞图案化的微型装置，并且该装置可以承受7天的细胞培养。
这项研究发表在科学杂志'公共图书馆一''（日期为 5 月 20 日：日本时间 5 月 21 日）。
使用交联白蛋白进行细胞图案化
在细胞生物学中，已知细胞群的空间排列是参与细胞群形态发生和组织功能表达的重要因素。因此，通常使用一种称为“细胞图案化”的方法来控制细胞粘附的区域，即通过化学表面处理将细胞粘附的基质表面（例如细胞培养皿的表面）划分为细胞粘附的区域和不粘附的区域。
团队负责人 Yo Tanaka 和他的同事是一种从海藻琼脂中纯化出来的生物聚合物琼脂糖[4]）的细胞图案化方法。注1-2)这些方法应用了用于制造硬币和汽车零件的“铸造”方法，并且可以在任何地方轻松制造。在硅橡胶表面制作一个深度为1毫米以下的细沟的“模具”，将琼脂糖水溶液倒入其中后，取出模具，琼脂糖就被塑造成模具的形状。用于细胞培养时，细胞不会粘附在琼脂糖覆盖的区域，因此将琼脂糖覆盖的区域与非琼脂糖覆盖的区域分开，使细胞仅粘附在未覆盖琼脂糖的区域。
联合研究小组现在更仔细地研究了材料如何流入硅橡胶模具，并探索了用于细胞图案化的新材料。
联合研究小组应用半导体制造中使用的一种称为光刻的方法在硅橡胶上雕刻出又长又窄的凹槽。将硅橡胶放在容器上，凹槽朝下，在真空中放置约一个小时，以除去溶解在硅橡胶中的气体分子。当压力恢复到大气压时，气体分子溶解到硅橡胶中，这会在硅橡胶包围的空间中产生真空。该真空用于将不同粘度的溶液吸入不同尺寸的硅橡胶凹槽中（图1A）。此时，我们观察溶液如何流入凹槽并计算单位时间内溶液流动的量（图1B-C）。
分析结果令人惊讶地表明，虽然即使是高粘度液体也可以像水等光滑液体一样被吸入凹槽中，但凹槽的尺寸（例如高度和宽度）会极大地影响流速（图 1D-E）。这表明，无论粘度如何，都可以使用多种解决方案，流量由硅橡胶吸入的气体量决定，并且硅橡胶包围的面积越大，平均吸入量越大。此外，我们构建了一个考虑硅橡胶中气体吸入的模型，并通过数值模拟成功再现了实际液体流速（图1C）。
图1 溶液流入硅橡胶模具分析
(A)解决方案引入原理。利用真空抽吸，将溶液引入硅橡胶制成的凹槽中。
(B) 溶液通过真空抽吸流入凹槽的时间过程。白色比例尺为5mm。
(C) 通过实验获得并通过模拟显示流量随时间的变化。模拟结果再现了实际流量。
(D) 溶液粘度与流速之间的关系。粘度和平均流速不相关。
(E) 凹槽高度与流量之间的关系。结果发现，凹槽高度越高，流入模具的量就越高。
接下来，我们考虑了哪些材料适合细胞图案化。我们关注的是 AIST 开发的一种名为“交联白蛋白”的蛋白质材料。白蛋白是血液中含量丰富的蛋白质，通常易溶于水并溶解在用于细胞培养的培养基中，因此不适合作为细胞培养装置的材料。另一方面，交联白蛋白水溶液是通过化学处理将多个白蛋白分子交联而成，干燥后可以加工成不溶于水的固体材料。因此，我们认为，通过将交联白蛋白水溶液倒入硅橡胶模具中并干燥，我们可以制造出即使在培养基中也能稳定使用的细胞培养装置。
实验结果表明，通过将交联白蛋白水溶液倒入硅橡胶模具中，抽真空，恢复到大气压，并在溶液干燥后取出模具，可以在一天内制作出细胞培养装置（图 2A-C）。与之前使用琼脂糖溶液的方法相比，设备的制备速度更快，而之前的方法需要三天多的时间才能干燥。
当我们使用我们创建的交联白蛋白细胞培养装置实际进行细胞图案化时，细胞不会像琼脂糖那样粘附在交联白蛋白上。在细胞培养皿中创建交联白蛋白的线性图案，并在培养基中培养 C2C12 细胞（一种源自小鼠骨骼肌的成肌细胞系）。为了进行比较，在使用常规非交联白蛋白制成的细胞培养装置中，细胞散布在整个装置中，并且不可能形成细胞图案，而使用交联白蛋白时，线性图案可以维持 7 天（图 2D、E）。
图2 交联白蛋白细胞培养装置的制备和细胞图案化
黑色比例尺为1厘米，白色比例尺为04毫米。
(A) 由放置在培养皿上的交联白蛋白制成的微型装置。
(B) 从模板中取出后培养皿上的交联白蛋白构建体的放大图像。交联白蛋白包被在两条直线之间。
(C) 使用共焦激光显微镜对使用槽高度为200μm的模板制作的交联白蛋白结构进行三维观察的结果。在交联白蛋白包被表面的边缘，沿着模板可以看到高度约7μm的3维结构。 1 μm 是毫米的 1/1,000。
(D) 使用正常白蛋白的细胞图案化结果。细胞遍布整个样品，使得图案化变得不可能。
(E) 使用交联白蛋白的细胞图案化结果。细胞不粘附在交联白蛋白包被的表面上，该表面保留了7天。
３．未来的期望
使用琼脂糖的细胞培养装置对于长期细胞培养来说是稳定的，但存在制造耗时的问题。通过使用本研究中使用的交联白蛋白，可以在更短的时间内生产，从而可以在需要时准备实验所需的物质，这有望有助于提高实验效率。
此外，所开发的微型装置是第一个通过将蛋白质溶液吸入硅橡胶模具中而制成的细胞培养装置。这次，我们使用“非细胞粘附”白蛋白来演示该方法，但这种利用硅橡胶微通道吸力的方法也可以应用于“细胞粘附”水溶性蛋白质。迫切需要研究细胞和细胞粘附蛋白之间的相互作用（细胞形状、发育和分化等细胞功能与细胞粘附蛋白之间的关系），并且认为使用具有特定形状结构的细胞粘附蛋白的微装置将应用于此类研究。
此外，RIKEN还提供包括硅橡胶模具在内的微加工器件服务注3)通过 AIST 开发的交联白蛋白，世界各地的研究人员将能够轻松使用这种方法。
4。论文信息
[标题]
使用脱气聚二甲基硅氧烷微通道进行微铸塑流动分析，用于使用交联白蛋白进行细胞图案化
[作者姓名]
Yigang Shen、Nobuyuki Tanaka、Hironori Yamazoe、Shunsuke Furutani、Hidenori Nagai、Takayuki Kawai 和 Yo Tanaka
[杂志]
公共图书馆一
[DOI]
101371/journalpone0232518
联合研究小组
RIKEN 生物系统研究中心
综合生物设备研究团队
队长田中洋
练习生沉一刚
高级研究员 Nobuyuki Tanaka
单细胞质谱研究团队
河井隆之研究员
产业技术综合研究所生物医学研究部
下一代医疗器械研究小组
研究小组组长 永井英典
首席研究员 Hironori Yamazoe
古谷俊介与研究组[返回来源]
研究支持
本研究是日本理化学研究所与米乐m6官方网站联合研究“挑战研究”和日本学术振兴会 (JSPS) 科学研究补助金（创新领域研究（研究领域提案类型））的一部分。 “搭载Gigiso（首席研究员：田中洋）的利用植物功能的智能机器的开发”得到了笹川科学研究补助金（20192031）和文部科学省留学生制度的资助。
注 1) 2017 年 4 月 6 日新闻稿“利用“任何地方的微观结构”分析干细胞分化模式」
注 2) 2017 年 12 月 21 日新闻稿“细胞个性的高通量分析」[返回来源]
注3) 2020年4月1日通知开始“微加工设备服务” [返回来源]