东京医科齿科大学发育与再生医学系、日本医科大学医学院骨科研究生院麻原博教授、日本医科大学医学齿科研究生院发育与再生医学系、庆应义塾大学医学院骨科系特等研究生望月佑介。通过与整形外科学院、产业技术综合研究所药物发现和分子分析研究中心等机构的共同研究，我们发现距离Sox9基因约1Mb的增强子以及与该增强子结合的名为Stat3的转录因子是控制肋软骨中Sox9基因运作的表达系统。这项研究的结果可能有助于阐明先天性骨发育不良（一种先天性骨发育不良）的病因。本研究得到文部科学省科学研究补助金（基础研究）和日本医学研究开发机构（AMED）创新性高级研究开发支援项目（AMED-CREST）“通过阐明机械生物学机制创造创新医疗器械和医疗技术”的支持。以肌腱和韧带为模型，并通过其应用创建生物韧带”（研发代表：浅原浩），该研究结果发表在国际科学杂志上发育细胞（发育细胞）。
SOX9 (SRY-box9) 是一种转录因子，在软骨细胞的分化和发育中发挥重要作用。已知SOX9基因或其周围的突变会导致严重的先天性骨发育不良（camomelic Dysplasia），其特征是骨软骨发育不良和性分化异常，但SOX9基因的开关部分（增强子）的独特之处在于它存在于很远的距离（约2Mb）的某处，因此迄今为止尚未阐明。
近年来，CRISPR 使基因改造成为可能 (聚集的规则间隔的短回文重复) /Cas系统识别增强子和控制表观遗传学的策略已被报道。通过结合这些系统，我们试图识别迄今为止未知的 Sox9 软骨特异性增强子。首先，我们使用逆转录病毒将在 Sox9 附近设计的 CRISPR/Cas 系统引入原代小鼠肋软骨细胞中，并通过染色质免疫沉淀和测序 (ChIP-seq)，我们发现了距 Sox9 约 1 Mb 的候选软骨增强子 (RCSE)（图 1）。
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图1位于Sox9上游1Mb左右的肋软骨特异性增强子（RCSE）鉴定示意图 A收集胎鼠的原代肋软骨细胞，并使用逆转录病毒检测Sox9启动子区域附近的区域引导RNA(gRNA)已停用 Cas9(dCas9) 后使用 HA 抗体进行 ChIP-seq 的示意图。
B ChIP-seq 结果。除了 gRNA 区域的强峰外，在距 Sox9 基因约 1 Mb 的位置也观察到显着峰 (RCSE)。 |
在成本软骨细胞中，证实当在该软骨增强子的候选区域中诱导具有阻止基因激活功能的表观遗传系统时，Sox9基因的激活减弱，这表明它具有基因开关的功能。
此外，当我们创建在 RCSE 激活位点处染成蓝色的 LacZ 转基因小鼠时，在肋骨软骨中观察到蓝色染色，表明 RCSE 是仅在肋软骨中激活 Sox9 的开关（图 2）。
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图2 通过将RCSE 区域连接到Sox9 启动子，使用包含LacZ 序列的载体创建转基因小鼠 A进行X-gal染色的E125和E145转基因小鼠的整体图像。在 E125 和 E145 处均观察到肋软骨特异性染色，并且在 E145 处的胸骨中也观察到染色。
B E145 转基因小鼠的切片。肋软骨和胸骨可见染色。 |
此外，当我们分析使用 CRISPR/Cas9 删除了软骨开关 RCSE 的基因敲除小鼠时，我们观察到仅胸部（包括肋软骨）发育不全和变窄（图 3）。此外，在切片中，仅在肋软骨中观察到增殖软骨细胞层变窄和肥大软骨细胞层增加。这表明该开关对于激活肋软骨中的 Sox9 基因至关重要。
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图 3 创建删除 RCSE 区域的基因敲除小鼠 A E165 的骨骼标本。在 RCSE 基因敲除小鼠中，仅观察到胸廓（包括肋软骨）变窄和发育不全。
B 10 周龄时的显微 CT 图像。与骨骼标本类似，在 RCSE 敲除小鼠中观察到胸廓变窄和发育不全。 |
最后，我们使用质谱仪分析了与该 RCSE 结合的蛋白质，发现 Stat3 (信号转导子和转录激活子 3) 已被识别。当这个 Stat3 基因被删除时，Sox9 变得不活跃，软骨发育受到抑制。
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| 图4 转录因子Stat3如何通过成本软骨特异性增强子RCSE区域控制Sox9表达的示意图 |
目前已经开发出多种分析基因组功能的方法，但各有优缺点，仍然存在许多无法解释的先天性、疑难杂症。
在这项研究中，我们通过结合迄今为止已报道的多种 CRISPR/Cas9 研究方法，首次阐明了肋软骨中 Sox9 基因的转换机制。这些结果将有助于阐明先天性骨软骨发育不良（campomelic Dysplasia）的疾病机制，并且预计本研究中使用的方法将用于其他疾病的研究。
已出版的杂志：发育细胞
论文标题：CRISPR/Cas9 组合方法阐明组织特异性 Sox9 表达的远上游增强子复合物