mile米乐集团 发现能够实现新心肌生产技术的基因

筑波大学医学院、庆应义塾大学医学院 Maki Ieda 教授（心血管医学）、Itaro Sadahiro 助理教授（心血管医学）、国立先进工业技术研究所（AIST）药物发现分子谱研究中心以研究组组长 Naoki Goto 为首的研究小组发现，心脏中胚层细胞可以直接由成纤维细胞和小鼠/人类多能性诱导干细胞只需引入基因 Tbx6。

迄今为止，已采取多个步骤从多能干细胞诱导心肌细胞。体液因素^（注3）首先诱导心脏中胚层细胞，即心脏干细胞，然后诱导心肌。然而，传统方法存在以下问题：1)诱导过程复杂，2)诱导效率不稳定，3)体液因子价格昂贵。 Ieda教授及其同事报道，作为一种心脏再生的新方法，通过将心肌诱导基因引入到心脏中存在的非心肌成纤维细胞中，可以直接在小鼠体内产生心肌细胞。然而，存在无法生成心肌以外的血管细胞、生成的心肌细胞无法增殖等问题。

在这项研究中，我们发现了 Tbx6，一种直接从成纤维细胞诱导心脏中胚层细胞的基因。此外，通过将Tbx6导入小鼠ES细胞和人iPS细胞等多能干细胞中，我们创造了无需使用体液因子即可有效增殖的心脏中胚层细胞，并成功地从这些细胞诱导出心肌细胞和血管细胞。作为其机制，我们揭示了 Tbx6 短暂地增加了对心脏发育很重要的 Mesp1 和 BMP4 基因的表达，并诱导心肌诱导。此外，通过调整Tbx6的表达周期，我们发现可以诱导骨骼肌和软骨细胞从中胚层分化，并发现Tbx6不仅是控制心脏，而且是控制整个中胚层从多能干细胞分化的重要因子。

这项研究开发了一种通过引入Tbx6来生产不使用体液因子的心肌和血管细胞的新方法。这项研究的结果预计将有助于开发简单、短期且廉价的心肌生产技术，该技术不仅将应用于心肌梗塞和扩张型心肌病等各种心脏疾病的再生医学，而且还将有助于药物开发。

*这项研究结果将于2018年8月9日（日本时间8月10日午夜）发布“细胞干细胞''中发布。

心力衰竭是全世界死亡的主要原因之一，需要开发新的治疗方法。由于心肌细胞无法再生，因心脏病而导致心功能下降的心脏会出现心力衰竭。来自ES细胞和iPS细胞等多能干细胞的心肌细胞有望成为心脏再生医学和药物开发的工具，并且正在积极进行有效诱导心肌细胞的研究。众所周知，心肌细胞是由干细胞通过中胚层细胞衍生而来，特别是心脏中胚层细胞。这些细胞具有自我更新的能力，不仅表现出高度分化为心肌的能力，而且还可以分化为心脏内的所有细胞，包括血管内皮细胞。另一方面，众所周知，从干细胞诱导心脏中胚层细胞需要多种体液因子。然而，除了这些药物成本高昂之外，不稳定且复杂的诱导过程一直是心脏再生医学的挑战。此外，心脏中胚层诱导的分子机制以及控制选择性分化的基因的存在至今尚未阐明。因此，我们开始这项研究时相信，如果我们阐明这一机制并发现控制心脏分化的基因，则有可能仅通过控制基因表达而不使用体液因子来诱导心肌诱导。

在这项研究之前，2010 年，Ieda 教授和他的同事发现 Gata4、Mef2c 和 Tbx5 作为生成小鼠心肌细胞所必需的“心肌诱导基因”（对应于“山中因子”，这是建立 iPS 细胞时细胞重编程所必需的四个因子）(Ieda 等人，Cell，2010）。此外，我们还报道，通过将三种心肌诱导基因导入小鼠体内的成纤维细胞中，可以将心内成纤维细胞转化为心脏内的心肌细胞（稻川等人，Circ Res，2012）。此外，最近的研究改进了基因转移方法，并成功建立了一种心脏再生方法，可以在短时间内有效诱导心肌而不破坏细胞基因组（Miyamoto 等人，细胞干细胞，2018）。然而，存在以下问题：使用该方法产生的心肌细胞不具有增殖能力，并且无法产生与心肌一起用于心脏再生所必需的细胞（例如血管）。

1。筛选来自成纤维细胞的心脏中胚层诱导因子

米乐m6官方网站拥有的 cDNA 文库 (HuPEX、Goshima 等人。自然方法，2008)用于筛选诱导心脏中胚层的基因。心脏中胚层DNA 微阵列^（注4）利用这些数据，我们选择了58个在心脏中胚层中特异性表达的候选基因，并将这些基因一一导入小鼠成纤维细胞中。结果，仅从导入了调节发育的转录因子Tbx6的细胞中诱导出表达心脏中胚层特异性基因Mesp1的细胞群（图1）。 Tbx6诱导的细胞长时间维持心脏中胚层状态，并且不会自发分化为心肌，表明Tbx6是诱导心脏中胚层的基因。

Tbx6，目前还不知道与心脏中胚层相关，但在小鼠体内的中胚层细胞中发现单细胞 RNA 测序数据^（注5）研究表明，表达 Tbx6 的细胞表达心脏中胚层和心脏祖细胞的基因。因此，为了研究Tbx6在心脏发育中的作用，我们决定利用体液因子分析Tbx6在小鼠ES细胞心肌诱导过程中的作用。

结果，我们证实 Tbx6 基因在源自 ES 细胞的心脏中胚层中表达。进一步CRISPR-Cas9^（注6）在ES细胞中删除Tbx6基因时，心脏中胚层和心肌的诱导被显着抑制，这表明Tbx6是体内心脏发育和多能干细胞心肌诱导的重要因素。

2。使用Tbx6表达控制的小鼠ES细胞建立心脏中胚层/心肌诱导方法

下一个 Tbx6Tet-On 慢病毒系统^（注7）将其导入小鼠ES细胞中，建立了可自由控制Tbx6基因表达的实验系统。当我们研究单独表达Tbx6是否可以诱导中胚层、心脏中胚层和心肌细胞时，大约88%的ES细胞在不使用体液因子的情况下被诱导为中胚层细胞。另一方面，如果在不使用体液因子的情况下Tbx6不表达，则不能产生中胚层细胞。 Tbx6表达下诱导的大多数中胚层细胞是心脏中胚层细胞，其中大约67%被诱导为心肌细胞。该诱导效率等于或高于使用体液因子的心肌诱导效率（图2）。此外，除了心肌细胞之外，我们还确认了向血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的分化，并确认了向构成心脏的所有细胞的分化。

3。阐明 Tbx6 表达诱导心脏中胚层的机制

使用微阵列的综合遗传分析表明，Tbx6 升高与中胚层和心脏发育相关的基因，并抑制与神经发生相关的基因。染色质免疫沉淀^（注8）的分析研究表明，Tbx6 直接与对心脏分化很重要的基因 Mesp1 和 BMP4 以及抑制分化为中胚层的基因 Sox2 结合，诱导 Mesp1 和 BMP4 的表达，同时抑制 Sox2 的表达。此外，Tbx6 诱导 BMP4、Nodal 和 Wnt3，它们是中胚层和心脏诱导的重要信号。旁分泌作用^（注9）已证实它可以促进心肌诱导。上述结果表明，Tbx6通过直接和间接作用诱导心脏中胚层。

4。确认通过 Tbx6 表达诱导小鼠 ES 细胞分化为骨骼肌和软骨

除了本研究揭示的中胚层发育早期阶段的功能外，Tbx6 还与轴旁中胚层的发育有关，而中胚层是骨骼肌和软骨的来源。由于这些器官在心脏之后发育，因此我们能够通过将 Tbx6 表达时间延长到诱导心脏中胚层所需的时间以上来生成近轴中胚层细胞。通过进一步调整培养条件，从诱导的轴旁中胚层中分别诱导出骨骼肌和软骨细胞。

我们还研究了同一基因 Tbx6 的表达周期控制向心肌或骨骼肌分化的机制，并发现延长 Tbx6 的表达周期会诱导一组抑制心脏分化的基因。基于上述，我们发现Tbx6是一种重要的中胚层诱导调节因子，控制心血管和肌肉骨骼系统的分化（图3）。

5。使用Tbx6表达控制的人iPS细胞建立心脏中胚层/心肌诱导方法

接下来，我们同样使用Tet-On慢病毒系统将Tbx6基因导入人iPS细胞中，建立了一个实验系统，使我们能够自由控制Tbx6基因的表达。结果，我们证实，人类 iPS 细胞与小鼠 ES 细胞一样，只需表达 Tbx6 基因即可产生心脏中胚层，无需使用体液因子，并且还可以诱导分化为心肌细胞和血管细胞。

ES细胞、iPS细胞等多能干细胞来源的心肌细胞有望用于心脏再生医学和药物筛选。由于本研究开发的方法不使用昂贵的体液因子，因此可以将心肌引导方法所存在的问题降低约80%的成本，并有望对再生医学和心肌细胞的生产做出巨大贡献。特别是在药物开发筛选中，人们迫切期待一种廉价的产生人类心肌细胞的方法。今后，我们将利用本研究成果获得的Tbx6基因，应用小鼠和人多能干细胞的心肌诱导，进一步研究可用于药物发现和心脏毒性筛选的心肌细胞试剂盒的实际应用。如果通过推进这些研究能够以低成本提供稳定的人类心肌细胞供应，我们相信这将是实现心脏再生医学的重要一步。

*本研究得到日本医学研究开发机构 (AMED) 再生医学实现中心网络计划“干细胞/再生医学创新创造计划”和“个人技术开发项目”、高级药物研究基金会、武田科学基金会、第一三共生命科学研究基金会和 JSPS 的支持。这项工作得到了科学研究补助金 JP17H04179、JP16K19426 和 JP18K08114、中富健康科学基金会、宫田心脏病研究基金会、庆应义塾大学博士生研究支持计划、庆应义塾大学医学院研究补助金和日本心脏基金会的支持。

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注1) 心脏中胚层

中胚层是发育早期形成的细胞群之一，形成循环系统和骨骼系统的基础，并分化为心脏、骨骼肌和软骨。特别是，心脏中胚层可以增殖并分化为几乎所有心脏构成细胞，包括心肌、血管内皮和血管平滑肌。[返回源]

注2) 多能干细胞

具有自我更新能力和多能性的细胞，可以分化成构成身体的各种细胞。胚胎干细胞 (胚胎干细胞：ESC) 和诱导多能干细胞 (诱导多能干细胞：iPSC）。[返回来源]

注3)体液因素

细胞释放的一种物质，通过传递与细胞间分化和增殖相关的信息而发挥作用。[返回源]

注4) DNA 微阵列

一种可以使用 DNA 芯片对许多基因进行综合分析的方法。[返回来源]

注5)单细胞RNAseq

一种可以破译单个细胞中 mRNA 序列并量化表达水平的方法。[返回来源]

注 6) CRISPR-Cas9

基因组编辑技术，允许在基因组中的特定位置删除、替换或插入基因序列。[返回来源]

注7) Tet-On慢病毒系统

一种用于创建细胞的系统，其中可以使用慢病毒载体随时调整基因表达，该系统包含允许靶基因仅在多西环素存在下表达的机制。[返回来源]

注释 8) 染色质免疫沉淀

一种分析蛋白质和基因是否直接相关的方法。在本研究中，我们分析了Tbx6蛋白是否直接与靶基因结合。[返回来源]

注9) 旁分泌作用

体液因子作用于附近的细胞。[返回参考源]