国立先进产业技术研究所 [会长：中钵良二]（以下简称“AIST”）环境管理研究部 [研究主任：田中干也] 环境微生物研究组高级研究员金成培和庆应义塾大学 [院长：长谷山明] 理工学院应用化学系铃木幸二名誉教授、Citterio Daniel 教授和 Ryo西原，科学与工程研究生院博士生（2017年9月完成），共同荧光染料生物发光自然生物发光底物（腔肠素，nCZT）。这些是 AIST 独有的人工生物发光酶ALuc® 反应； AIST商标）和Renilla生物发光酶（RLuc），获得了从蓝色到红色的多种发光颜色。这种颜色变化是发光底物的能量转移到荧光染料的现象（化学发光/生物发光共振能量转移现象 (CRET/BRET)）。我们开发的一些发光底物可以与发光酶选择性地发光，因此即使在复杂化学物质共存的系统中，也只能使特定的发光酶发光。也是引入荧光染料的合成中间体叠氮化物基团的发光底物以酶选择性的方式发出极其明亮的绿光。这些成就带动了高灵敏诊断试剂、癌症早期诊断等各个领域的发展。生物测定，有望广泛应用于生物成像等领域。
该研究成果发表在美国化学会杂志上生物共轭化学，2018 年 5 月 16 日版（东部夏令时间）。
使用带有荧光染料的发光底物显示酶选择性和多色发光的生物发光系统
生物发光是萤火虫和海肾（海洋生物）等生物体内的生物发光酶（催化发光化学反应的生物酶）与生物发光底物发生特定催化反应，将底物中储存的化学能以光的形式释放出来的现象。生物发光在各种生物测定中用作发光标记，因为它通常对生物体无害并且不需要复杂的检测器。
生物发光的背景信号比荧光低，是一种高灵敏度的发光标记，但发光本身较弱，发光颜色有限。如果能够开发出克服这些问题的发光技术，将带动更高性能的生物测定系统的发展，并将产生从基础医学到工业应用的巨大连锁反应。
庆应义塾大学在世界上率先开发出具有多种化学结构的发光底物。此外，AIST 还开发了与人工生物发光酶 (ALuc®) 相关的独特研究领域。由于生物发光是通过发光底物和发光酶之间的催化反应产生的，因此我们决定结合庆应义塾大学的发光底物技术和AIST的发光酶技术来开发一种新的生物发光技术
此项开发得到了日本学术振兴会科学研究补助金 A（2017 财年 - 2020 财年）、基础研究 B（2016 财年 - 2016 财年）和挑战性探索性研究（2016 财年 - 2019 财年）的支持。
这次，我们对腔肠素 (CTZ) 和 AIST 自己的人工生物发光酶 (ALuc®) 的结构进行了计算科学模拟，腔肠素 (CTZ) 是一种天然发光底物，可以与海肾发光酶 (RLuc) 的酶活性位点结合，其晶体结构已知，AIST 自己的人工生物发光酶 (ALuc®)（图 1）。结果，预计对发光酶ALuc®的发光底物的C-2位置和发光酶RLuc的C-6位置进行化学修饰将极大地影响底物与酶之间的结合。
图1 生物发光酶的典型底物-发光酶结合模型
因此，将叠氮基团(N3)，进一步利用叠氮基的反应性引入荧光素（FITC）、尼罗红（Nile-R）、荧光素琥珀酰亚胺酯（SFX）、2,6-二甲氧基-1,3,5三嗪（DMT），通过引入二氢卟酚等荧光染料小分子，合成了一系列新型荧光染料发光底物（图2、3和4；nCZT表示天然腔肠素，缩写数字表示引入荧光染料和叠氮基团的碳位置）。迄今为止，只有一种情况是将荧光染料引入发光底物中，并且只产生了一种底物（Chem Asian J 2011, 6, 1800）。
图2天然生物发光底物（腔肠素）C-6位荧光染料修饰示意图
图3荧光染料发光底物的概念（左）及其示例（右）
我们还开发了一组新的人工生物发光酶 (ALuc®)，它们可以针对新合成的发光底物发出最佳的光。在AIST，我们为我们开发的ALuc®的名称分配了唯一的编号，因此这次我们还给了新的ALuc®类型名称，例如ALuc17和ALuc18。这些是通过参考ALuc®的现有氨基酸序列，从发光浮游生物的发光酶数据库中提取频繁出现的氨基酸，并修改序列以增加每个序列之间的氨基酸同源性而创建的。
图4 新合成的荧光染料发光底物的化学结构
黄色阴影代表引入的官能团。
这一开发基于这样的工作假设：带有荧光染料的发光底物与发光酶反应产生能量，并且该能量被传递到荧光染料，导致其发出与没有荧光染料时不同颜色的荧光。事实上，当我们通过用荧光染料氧化新开发的发光底物来诱导化学发光时，它表现出从蓝色到红色的各种化学发光颜色（图5（A））。据认为，通过化学发光共振能量转移(CRET)将发光底物产生的共振能量转移到荧光染料上，导致发射各种颜色的光。当这些带有荧光染料的发光底物与ALuc16（本次开发的人工生物发光酶之一）混合时，观察到似乎是由于生物发光能量转移（BRET）引起的光谱（图5（B））。另一方面，叠氮化物类发光物质6-N3-CTZ与生物发光酶RLuc86-535混合时，发光为蓝色（约400 nm），但当与发光底物6-FITC-CTZ（其叠氮基上附着有荧光染料）混合时，它发出绿光（约522 nm）（图5（D））。使用另一种生物发酵酶 RLuc8 观察到类似的着色现象（图 5 (C)）。
这样，通过将荧光染料引入到发光底物中，获得了各种发光颜色。通过改变引入的荧光染料，预计可以创造出更多种的发光颜色。
图5(A)通过荧光染料的发光底物的化学发光共振能量转移(CRET)的发射光谱
(B) 在人工生物发光酶 (ALuc16) 共存下，发光底物与荧光染料的生物发光共振能量转移 (BRET) 的发射光谱
(C)海肾生物发光酶(RLuc8)共存时发光底物与荧光染料的BRET发射光谱
(D)海肾生物发光酶(RLuc86-535)共存时发光底物与荧光染料的BRET发射光谱
带有叠氮基团的发光底物（6-N3-CTZ，2-N3-CTZ)也与ALuc®组混合，并研究其发射亮度和发射颜色（图6）。结果，与不含叠氮基团的天然发光底物（nCTZ）相比，发光亮度明显增强（图6（A）），并且发射颜色也发生变化（图6（B））。对于需要强发光的应用可以考虑应用。
只有当特定发光底物和发光酶结合时才能观察到特定发光现象。例如，在对活体动物细胞进行成像时，证实了类似的特定发光现象。因此，还可以想到进行其中两种或更多种特定发光底物和发光酶的组合共存的生物测定（多重测定）。
这次，作为克服荧光和生物发光局限性的新方法，我们能够创建一种独特的发光系统，将荧光染料融入天然生物发光底物中，可以说我们能够实现前所未有的发光特性（各种发光颜色、酶选择性发光、高亮度等）。
图6(A)新型人工发光底物与发光酶组合的相对发光亮度比较
（RLU：相对光单位）
(B) ALuc16共存时各发光底物的发射光谱
视频 1：人工生物发光酶 (ALuc16) 的新型发光底物（6-N3-CTZ)
基于这一结果，我们将致力于开发具有更高亮度、更高稳定性和近红外发射特性的生物发光基板。此外，我们还将同时开展研究，将新开发的发光系统应用于实际的生物成像和生物测定，以创建创新的分子成像模型。