国立先进产业技术综合研究所［理事长中钵良二］（以下简称“AIST”）生物医学研究部［研究主任大宫胜宏］北海道大学脑基因研究组主任研究员落石智代［理事长山口敬三］高等生命科学研究所北村明教育法人顺天堂助教授［理事长：小川秀兴］与副教授合作Hideki Shimura，顺天堂大学医学院神经内科，阿尔茨海默病的致病因素之一β 淀粉样蛋白 (Aβ)的动态在活的神经元和体内。
Aβ很容易聚合并进一步聚集形成大的聚集体。 Aβ 和荧光蛋白GFP8816_9069低聚物
该技术有望应用于利用培养细胞和活体个体筛选阿尔茨海默病治疗候选物质，并有助于阐明阿尔茨海默病的发病机制。该结果的详细信息将于 2016 年 3 月 16 日发布科学报告杂志（电子版，开放获取）。
 |
| 开发的Aβ-GFP融合蛋白（左）及其在培养细胞和线虫中表达的示意图（右） |
老龄化社会导致的痴呆症患者数量的增加正在成为世界范围内的一个重大社会问题，因为它与当前的医疗费用和护理系统状况交织在一起。特别是阿尔茨海默病会导致记忆障碍和判断能力下降。迷失方向之类的症状占痴呆症病例的一半以上，其发病的详细机制尚未阐明，也没有开发出有效的治疗方法或特效药物。
10144_10277磷酸化曾经Tau 蛋白在神经细胞中积累神经原纤维缠结还有痴呆症，其主要病理特征是脑萎缩。尽管这些都是阿尔茨海默病的潜在原因，但阿尔茨海默病的发病机制尚未阐明。在此背景下，最近流行一种理论，即由少量Aβ分子聚合而成的Aβ寡聚物对细胞具有很强的毒性，并且它们在细胞内的积累与疾病的发生密切相关。然而，使用传统方法只能使用细胞或脑组织标本进行分析，因此需要一种直接可视化活细胞中 Aβ 寡聚状态并详细分析其与毒性的因果关系的方法，以及直接分析潜在治疗剂物质对 Aβ 聚合的影响的新方法。因此，细胞的可视化、神经元功能的分析、转基因动物并分析活细胞内的分子相互作用荧光相关光谱
迄今为止，作为连接Aβ和GFP的连接体，报道了由12个或更少的氨基酸组成的连接体，但由于当Aβ聚合时GFP的荧光消失，因此尚未观察到高毒性的低聚物。这次，我们开发了一种Aβ-GFP融合蛋白（Aβ-GFP），它使用14个氨基酸作为连接体连接Aβ和GFP，即使形成Aβ分子的聚合物也可以观察到荧光。这个Aβ-GFP核磁共振装置、电子显微镜、免疫组织化学和荧光相关光谱分析表明，由于GFP融合，Aβ聚合不会超过一定水平，并且在体内和体外均以主要由二聚体和四聚体组成的寡聚体形式存在（图1）。利用这些特性，可以分析活细胞内 Aβ 的动态运动及其在原代培养神经元内的积累状态。此外，由于寡聚物的毒性比聚合后纤维状的Aβ更强，因此可以分析Aβ寡聚物的聚合度与对细胞的毒性之间的关系。
 |
| 图1 Aβ-GFP体内和体外 |
(A) Aβ 蛋白 (a) 和 Aβ-GFP (b, c) 的电子显微镜图像。当Aβ蛋白聚合并变成纤维状时，Aβ-GFP中途停止聚合并形成寡聚物（c中虚线包围的每个区域表示一种聚合物）。
(B) Aβ-GFP 表达COS7 细胞(b) (a) 用仅识别寡聚体的抗体染色的图像。由于(a)和(b)几乎匹配，(c)可以看出Aβ-GFP是寡聚物。 |
另外，如果连接Aβ和GFP的连接体较短，则由于聚合的影响，将观察不到GFP荧光。因此，我们设计了一种可以利用这次发现的现象检测聚合状态的系统，并证明可以利用 GFP 的荧光强度筛选治疗药物候选物（图 2）。在仅在特定神经元中表达GFP的转基因蠕虫中，可以在神经元内观察到清晰的荧光（图2a），但是在表达具有由两个氨基酸组成的短连接子的Aβ-GFP的蠕虫中，由于Aβ聚合的影响，没有观察到GFP荧光（图2b）。这种线虫抑制 Aβ 聚合姜黄素的培养基中培养的结果是，可以观察到GFP荧光（图2c）。这样，Aβ-GFP可以通过测量荧光强度的变化来筛选抑制Aβ聚合的候选药物。
 |
| 图 2 使用活生物体筛选药物发现候选物的示例 |
| 当在显微镜下观察培养介质(A)上的线虫时，可以看到由于姜黄素(B)抑制Aβ聚合而荧光强度增加的神经细胞。白色圆圈表示神经元细胞体，箭头表示神经元轴突。 |
未来，我们将利用培养的神经元开发一种方法，利用Aβ-GFP的荧光强度来更轻松地筛选阿尔茨海默病的治疗和预防药物候选物。此外，我们将使用新开发的表达Aβ-GFP的转基因小鼠，更详细地分析Aβ寡聚体对阿尔茨海默病发病早期神经细胞内部发生的微小变化的影响，并推进研究以阐明阿尔茨海默病的发病机制并预防它。