米乐m6官方网站【会长：吉川博之】（以下简称“AIST”）神经信息学研究部【研究主任：田口贵久】结构生理学研究组研究组组长：佐藤千敏、首席研究员：小仓俊彦、日本电子株式会社【社长：栗原】项目负责人菅光雄（以下简称“JEOL”）副首席研究员Hidetoshi Nishiyama与山形县工业技术中心电子信息技术部的Yoshiyuki Watanabe博士[主任Takeshi Musashi]共同开发了大气压力，可以在大气压力下观察湿样品和溶液中的样品。扫描电子显微镜（大气扫描电子显微镜：ASEM）（图1）。
现有的电子显微镜在真空中观察样品，因此无法观察湿样品或溶液中的样品。通过开发一种称为“薄膜皿”的用于放置样品的特殊皿，可以观察湿样品或溶液中的样品。薄膜盘底部开有传输电子束的耐压薄膜窗口，电子束从下方进入。薄膜皿上部敞开，放置光学显微镜同一视场观察，用扫描电子显微镜（SEM）测量10 nm（nm：纳米为10）。-9m)级高分辨率观察。由于可以在常压下观察湿样品或溶液中的样品，不再需要以前需要一到几天的样品脱水和干燥等预处理，观察效率可以得到显着提高。此外，可以避免样品因干燥而变形。
这项技术可以在开放的样品室中进行电子显微镜观察，是日本独有的，预计会得到巨大的发展，因为它不仅可以用于基础生物学，还可以用于未来处理湿样品的药物发现和医疗环境。
该结果将于2008年12月9日至12日在神户举行的“第31届日本分子生物学会年会和第81届日本生物化学会年会”上公布。
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图1用于大气压观察的原型SEM、光学显微镜图像和液体中细胞的SEM图像 |
<依赖光学显微镜的医疗技术>
医学科学日益进步，我们正在从依靠经验转向细胞分子水平的研究。光学显微镜主要用于观察细胞。光学显微镜已成为一种强大的工具，使我们能够将其与荧光观察方法相结合来观察生物分子的运动。然而，由于光的波长较长，分辨率仅限于02μm左右，为了推进研究，需要观察更精细的结构。
<传统电子显微镜>
电子显微镜具有高分辨率，但它们是在真空中观察样品的设备。因此，需要对样品进行一到几天的预处理，包括脱水和干燥。由于扫描电子显微镜（SEM）采用金属气相沉积法制备观察标本，透射电子显微镜（TEM）采用塑料包埋法制备观察标本，因此样品是干燥的，无法观察观察时给予药物的反应。此外，无法用特定染料区分细胞器，因此难以识别细胞器。低真空 SEM 的开发目的是在不干燥湿生物样品的情况下直接观察它们。然而，由于样品被放置在1/100大气压以下的低真空中进行观察，因此在观察过程中水分会蒸发。因此，存在必须在样品完全干燥之前对其进行观察的问题。
最近，通过用薄膜将溶液中的细胞与真空分离，开发出了不需要脱水或干燥过程的封闭胶囊。该胶囊采用聚酰亚胺和氮化硅 (SiN) 薄膜之类的窗口允许电子束通过。然而，这种胶囊的体积很小，只有几十微升，并且是一个封闭的系统，无法进行长期培养和外部施用试剂。
因此，需要建立一种无需干燥细胞即可超越光学显微镜分辨率的观察方法。
神经信息学研究部正在研究如何利用电子显微镜来阐明容易被电子束破坏的蛋白质的结构。 JEOL 正在寻求开发一种无需样品预处理即可在大气压下进行观察的电子显微镜。自 2007 财年以来，我们一直在合作开发新型电子显微镜，通过将 AIST 的专业生物技术与 JEOL 的电子显微镜技术相融合，该电子显微镜可用于利用液体和气体阐明疾病机制和药物发现研究。
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图 2 原型大气压扫描电子显微镜 |
＜手持式电子显微镜＞
在普通电子显微镜中，电子枪位于样品上方，因此电子束从样品上方照射。开发的电子显微镜（图2）是倒置SEM，底端有电子枪，电子束从样品下方照射。
如图3所示，其结构是在底端有一个电子枪，在电子束出射的顶端设置一个可容纳1-2ml液体的样品盘。皿的底部配备有采用半导体微加工技术（与山形县工业技术中心合作）制造的氮化硅（SiN）薄膜窗口（以下简称“薄膜皿”）。我们在世界上第一个证实这种SiN薄膜即使厚度只有10纳米也能承受1个大气压的压差。目前，该原型机将使用厚度为100 nm的薄膜，以降低薄膜损坏的风险并促进广泛使用。即便如此，它仍然足够薄，可以让电子束通过，而不会牺牲高分辨率。
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图3大气压扫描电子显微镜结构图。光学显微镜放置在倒置 SEM 对面，中间有一个薄膜盘。薄膜培养皿能够培养细胞，并且底部有一个SiN薄膜窗口。这种薄膜足够薄，可以传输电子束，但可以保持大气压力。通过薄膜用电子束照射细胞并检测液体中细胞反射的电子，可以获得高分辨率 SEM 图像。此外，可以使用光学显微镜利用荧光来识别该位点。 |
通过将培养液放入该薄膜培养皿中，仅用薄膜培养皿就可以长时间培养细胞。如果将培养后的薄膜培养皿设置在SEM中，则从薄膜下方用电子束照射培养的细胞，通过薄膜下方的检测器检测从细胞反射的电子以进行SEM观察。
这样就不需要普通电子显微镜所需的预处理。由于样品没有干燥，因此样品不会变形，可以快速观察。此外，该原型设备还配备了光学显微镜，该显微镜在薄膜上方配备了浸没式透镜，可以与 SEM 交替观察同一细胞的相同视场。此外，由于薄膜皿的顶部是开放的，因此易于施用药物等，并且可以在施用后立即进行SEM观察。
<一些观察>
确认溶液中的细胞的SEM图像和光学显微镜图像的示例如下所示。
(1) 在细胞内实现高速和高分辨率内质网的结构
细胞内内质网在神经信息传递的发育和器官的形成中发挥着重要作用。在这里，我们在薄膜培养皿上培养非洲绿猴肾细胞并观察细胞内内质网。细胞培养后，用戊二醛防止细胞变形已修复然后进行荧光染料染色和SEM染色（通过染色使重金属附着在样品表面和内部）。所需时间约为1分钟。使用光学显微镜（绿色）确认内质网的位置，并使用SEM对相同视野进行成像。在图4中，黑白照片是使用SEM交替观察的结果，绿色照片是使用光学显微镜交替观察的结果。不再需要以前需要一到几天的脱水和干燥等过程，从而加快了加工速度。此外，虽然光学显微镜的清晰成像极限约为 2,000 倍，但我们成功地使用 SEM 在 20,000 倍下捕获了清晰的图像。这使我们能够详细确认内质网的结构。另一个样品的分辨率达到 8 nm [见附录]。这样，已经证实，以前用光学显微镜难以观察到的细胞的精细结构，可以通过溶液中的SEM在短时间内观察到。
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图4细胞内内质网的观察。使用光学显微镜确认荧光染色的内质网的位置，并使用SEM进行高分辨率成像。 |
(2)观察细胞吞咽异物的瞬间
分解和消灭进入体内的病原微生物和异物是免疫系统的重要功能。第一步是细胞清除异物。吞噬作用观察细胞的摄取。在这里，整个细胞被染成红色，细胞周围发黄光的微粒（产品名称）被染成红色。Qdot®直径10-20nm)作为异物被喷射。由于该装置的样品室是开放的，因此可以轻松地喷射药物。
首先，我们使用光学显微镜观察细胞通过吞噬作用摄取微粒的瞬间。此后，用戊二醛固定细胞，进行SEM染色，并通过SEM进行观察。
结果如图5所示。在荧光图像中，可以在箭头所示的六个点处确认吞噬颗粒的位置。 SEM 图像中、荧光图像中光晕的出现，看似一块的实际上是两块（图5左端，粗箭头），我们能够确认其周围的详细结构。这样，就可以使用光学显微镜观察细胞动态，并使用 SEM 在同一视场中捕获关键时刻的高分辨率图像。
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图5细胞吞噬作用的观察。光学显微镜图像中出现的六个微粒位置之一在SEM图像中被确认为两个（左端、粗箭头），并且可以确认周围区域的精细结构。 |
<当前点>
通过这种方式，该原型机可以将样品保持在完整的气氛中，从而更容易从外部管理试剂。无需以前所需的脱水、干燥等预处理，且不存在样品变形，使得高分辨率、快速的SEM图像观察成为可能。还可以用光学显微镜图像交替观察同一视野，从而可以使用荧光染色来识别区域。
该装置还可以应用于在真空中难以观察的潮湿样品（食品、化妆品、聚合物等）和气体中的细颗粒，甚至在基础生物学以外的领域也是如此。这种方法也可以应用于免疫电子显微镜，使特定蛋白质发出荧光，并使用 SEM 获得高分辨率图像。这使得观察使用光学显微镜无法清楚看到的结构成为可能，因此有望用于药物发现和医疗环境。
(1) 实现令人惊叹的 8 nm 分辨率
细胞膜表面聚糖是参与生物体分化、发育等多种生理现象的重要组成部分。将细胞培养在薄膜培养皿上（SiN膜厚度为30 nm），并将特异性吸附糖链的金颗粒（直径15 nm）撒在细胞周围。如 SEM 图像（图 6a）所示，我们可以观察到与糖链分布相匹配的白点或金颗粒，从而证实了整个细胞表面都存在糖链。图 6b 是放大倍数增加的 SEM 图像，可以清楚地识别出糖链的位置。相邻金颗粒之间的最小可识别距离为 8 nm（图 6c），证实了高分辨率。
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图 6 糖链上吸附有金颗粒 (15 nm) 的细胞的液体 SEM 图像。可以确认糖链的位置，并且确认了分辨率为8nm。 |
(2) 观察神经的微小连接（了解大脑）
观察到神经细胞（PC12：大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤来源的细胞）的细胞间通讯（图7）。神经细胞彼此神经突的拉伸和连接。计划将其应用于阐明记忆机制。
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图 7 神经细胞之间的通讯。可以确认神经突之间的连接。 |