米乐m6官方网站【会长：吉川博之】（以下简称“AIST”）基因组工厂研究部【研究主任：蒲形阳一】基因表达工程研究组组长田村智宏与旭化成制药公司合作【总裁兼代表董事：稻田勉】免疫抑制剂用作咪唑立宾的血液浓度。 （MZR），并开发了一种有效的生产方法。
米佐立宾抑制肾移植中的排斥反应。狼疮性肾炎・类风湿性关节炎然而，确保疗效和治疗安全性的咪唑立宾最佳剂量仍存在不确定性，有人指出，为了确定每个个体的最佳剂量，需要在测量血药浓度的同时调整剂量。
目前可以通过高效液相色谱法(HPLC)测定咪唑立宾的血药浓度，但费力费时。使用新开发的酶，可以在短时间内进行简单的测量。该技术的详细内容将在2008年11月27日至30日在名古屋国际会议中心举行的日本临床检验医学会第55届年会上公布。
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利用新发现的咪唑立宾激酶测量咪唑立宾浓度的原理
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NAD＋：氧化型辅酶，NADH：还原型辅酶
由于可以通过340纳米波长处的吸光度容易地测量第二反应中产生的NADH的浓度，因此可以计算咪唑立宾的浓度。
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咪唑立宾（MZR）是一种低分子化合物（分子量259），广泛用于抑制肾移植排斥反应、治疗狼疮性肾炎、类风湿性关节炎等。然而，为了确保疗效和安全性，咪唑立宾的最佳剂量仍存在不确定性。尽管与其他具有相似功效的药物相比，咪唑立宾引起的白细胞减少等血液系统疾病较少，但它主要通过肾脏排泄，因此肾功能不全患者的排泄可能会延迟。骨髓抑制可能会发生。因此，近年来有人指出有必要通过测定血药浓度来调整剂量。
目前，咪唑立宾的血药浓度可以通过高效液相色谱法（HPLC）进行测定。然而，HPLC测量存在以下问题：(i)设备设施有限；(ii)需要样品预处理；(iii)测量需要时间并且不可能同时测量多个样品；(iv)与其他血液成分的分析相比，所需的样品量大（至少08毫升）。因此，为了在更短的时间内实现更简单的测量，需要开发一种可以使用通用自动分析仪测量的咪唑立宾血药浓度的测量方法。
产业技术研究院基因组工厂研究部基因表达工程研究组放线红球菌(红平红球菌)构建化学物质和蛋白质生产系统的研究。特别是放线菌生产蛋白质其特点是可以生产利用大肠杆菌现有技术难以生产的蛋白质。另一方面，旭化成制药株式会社诊断试剂产品部正在开发诊断试剂用酶以及使用酶的诊断试剂。因此，产业技术研究所与旭化成制药公司合作，致力于开发利用红球菌属放线菌生产诊断试剂用酶的技术。
使用该技术测量咪唑立宾浓度的原理由两个反应组成，如图1所示。
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图1利用新发现的咪唑立宾激酶测量咪唑立宾浓度的原理
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NAD＋：氧化型辅酶，NADH：还原型辅酶
第二反应中产生的NADH浓度可以通过340纳米波长处的吸光度轻松测量，从而可以计算出咪唑立宾的浓度。
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在第一个反应中，磷酸盐通过咪唑立宾激酶的作用与咪唑立宾结合，形成咪唑立宾 5'-单磷酸 (MZR-P)。这个MZR-PIMP脱氢酶的作用，因此通过测量第二反应中的抑制程度来计算MZR-P浓度，即咪唑立宾浓度。 IMP脱氢酶是一种将化合物IMP（肌苷单磷酸）转化为化合物XMP（黄苷单磷酸）的酶，XMP又转化为化合物NAD+（辅酶氧化形式）变成化合物 NADH（辅酶还原型）。通过测量 340 纳米波长处的吸光度，可以轻松测量 NADH 的浓度。由此，算出IMP脱氢酶的酶活性的抑制程度，并由MZR-P浓度算出咪唑立宾浓度。
由于尚不清楚哪种酶在第一步中发挥作用，即人体内磷酸化咪唑立宾的酶，因此我们从包含基因组信息的数据库中搜索了预测基因。我们在大肠杆菌中表达了多个候选基因作为重组蛋白，并研究了产生的蛋白是否具有磷酸化咪唑立宾的能力。然而，当这些酶在大肠杆菌中产生时，产生的酶破坏了细胞内核酸和磷酸化核酸的浓度平衡，常常导致大肠杆菌死亡，这导致搜索没有进展。
AIST 红球菌放线菌 (红平红球菌)时，细菌并没有死亡，搜索变得更容易。源自各种微生物的酶基因在该放线菌中表达。结果，他们发现了一种磷酸化咪唑立宾的酶基因。此外，利用该基因，我们开发了一种有效的方法来生产放线菌中磷酸化咪唑立宾的酶。经过详细分析，发现这种酶是世界上第一个在细菌中发现的核酸磷酸化酶（核苷激酶)，并且已明确它是一种具有很高学术价值的酶。
我们开发了一种使用这种酶测量咪唑立宾血液浓度的酶法。图2显示了第一反应中该酶的磷酸化反应的HPLC分析结果。由于反应仍在进行中，因此残留有未反应的ATP和咪唑立宾，但证实ATP转化为ADP并且咪唑立宾转化为MZR-P。第一个反应在 5 分钟内完成。
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图2 通过HPLC分析该酶对咪唑立宾的磷酸化反应（确认第一个反应）
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将第一个反应的反应液与第二个反应的测试溶液（IMP和NAD+和IMP脱氢酶），进行第二次反应，测量340纳米波长处的吸光度。由吸光度计算IMP脱氢酶酶活性的抑制程度，并计算MZR-P浓度和咪唑立宾浓度。结果与图 3 所示的 HPLC 浓度测量结果一致，证实可以准确测量血液中存在的咪唑立宾浓度。
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图3 酶法咪唑立宾(MZR)血药浓度测定结果与HPLC法的比较
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目前，测量咪唑立宾血浓度仅进行HPLC测量就需要18分钟，不包括样品预处理时间，每小时只能测量33个样品。采用这种酶法测定咪唑立宾血浓度，可以使用通用自动生化分析仪同时测定多个样本，每小时可以测定600个样本（使用通用自动生化分析仪日立7080型自动分析仪时）。
基于这项研究结果，AIST将进一步推进磷酸化咪唑立宾（MZR）的核苷激酶的功能分析，旭化成制药有限公司计划开发一种用于测量咪唑立宾血药浓度的试剂。