米乐m6官方网站[所长：吉川博之]（以下简称“AIST”）真实环境测量与诊断研究实验室[实验室主任坂本充]的首席研究员大场秀树和客座研究员鲁米亚娜·巴卡洛娃发现了具有前所未有的优异特性的荧光量子点并使用这个量子点进行蛋白质和 DNA/RNA 测量纳米生物混合材料此外，这种新材料还用于利用抗体检测微量蛋白质（免疫印迹法) 的人。
量子点是由半导体无机材料制成的几个纳米（纳米：十亿分之一米）的粒子，在紫外线照射下会发出强烈的荧光。生物成像、生物测量、光敏剂这样的光学材料受到了全世界的关注，激烈的研发竞争正在进行。 AIST已成功制备出具有以下特性的优异量子点：1）高发光性，2）有效尺寸分布，3）优异的光化学稳定性，4）不聚集，5）无闪烁现象。此外，这些量子点中的蛋白质亲和素或生物材料生物素结合的量子点，通过将两者结合，我们成功地显着提高了使用抗体检测蛋白质的灵敏度。
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量子点发出的荧光
小尺寸（2nm）发蓝色荧光，3nm发绿色荧光，4nm黄色荧光，大尺寸（5nm）红色荧光
激发波长为365nm
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未来，我们希望将这项技术应用于开发检测和识别天然蛋白质的电泳芯片。我们还计划开发一种量子点表面处理技术，专门标记食品制造过程（包括酿造）中产生或侵入的不良真菌和异物，并计划将该技术应用于评估技术以实现最佳过程控制。
该结果由美国化学会发表美国化学会杂志, 2005,127(26)、9328 和分析化学 2006, 87(1), 321。我们还计划在 Nanotech-2006 上进行演示，该展会将于 2 月 21 日至 2 月 23 日在东京国际展示场举行。
利用抗体检测靶蛋白的免疫印迹方法已经发展了20多年，但仍然是分子生物学和医学领域检测细胞和组织中蛋白质表达的主要方法。特别是在基因组功能分析和总蛋白（蛋白质组学）分析微阵列这是技术的基本方法之一。免疫印迹法虽然已经广泛应用了很长时间，但一直没有取得重大的技术改进，并且存在以下问题。 1）缺乏定量特性，2）操作过程复杂且耗时长，3）缺乏重现性，4）灵敏度太低，无法检测微量蛋白质，5）无法从细胞裂解液中直接检测，6）需要蛋白质沉淀和浓缩等预处理。
过去 10 到 15 年，有机荧光染料的公司建议将有机荧光染料与蛋白质亲和素结合用于免疫印迹中蛋白质的荧光检测。然而，由于有机荧光染料存在以下缺点，该方法尚未得到广泛应用。
- 有机荧光染料褪色快；荧光测量过程中荧光信号发生变化，导致定量变得困难。
- 当局部区域积累大量有机荧光染料时，会发生荧光信号的自猝灭，荧光信号显着减弱。
- 蛋白质通常应使用单分子有机荧光染料进行标记，但这严重限制了分析的灵敏度。
由于这些原因，需要开发新的免疫印迹技术。因此，我们专注于量子点，它不仅是荧光的，而且是纳米粒子。当量子点涂有各种其他无机/有机材料时，即使在高浓度下，它们的荧光也不会自猝灭。他们还着眼于生物分子生物素与蛋白质亲和素具有非常强的结合能力，并认为通过合成量子点-生物素和量子点-亲和素，将有可能将大量的量子点整合成三明治类型。我们认为这将使得在目标蛋白的局部区域积累大量量子点，并放大目标蛋白的荧光信号成为可能。
合成的量子点由一种称为硒化镉 (CdSe) 的材料制成，直径仅为 3 至 6 纳米（纳米：十亿分之一米）（图 1）。当它们暴露在紫外线下时，它们会根据其大小发出明亮的蓝色到红色荧光。这些量子点具有尖锐的荧光光谱（图2），这在生物成像等方面是非常有利的特性。
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图1 合成量子点的高分辨率透射电子显微照片
本次合成的量子点中，尺寸为3纳米的量子点
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图 2 取决于量子点尺寸的荧光光谱
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我们开发了一种将各种生物分子与量子点结合的技术，并利用该技术合成了一种将蛋白质亲和素和生物分子生物素与量子点结合的材料（图3）。
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图3 量子点与亲和素和生物素结合的示意图
左，量子点 - 亲和素 右，量子点 - 生物素
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接下来，这种材料与生物素标记的抗体结合，并应用于称为免疫印迹的蛋白质检测技术。
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图 4 检测细胞中存在的痕量蛋白（TRF1、Tin2）
左，常规免疫印迹分析方法A1；方案，A2； TRF1 和 Tin2 的带
正确，使用量子点 B1 进行免疫印迹分析；方案，B2； TRF1 和 Tin2 的谱带
数字表示细胞裂解液中以下每种目标蛋白的浓度。
1：10μg 2：20μg 3：30μg 4：40μg 5：50μg。
TRF1：端粒结合因子(56KDa)
锡2:TRF1 相互作用核蛋白2 (40kDa) ,
两者都是在慢性粒细胞白血病细胞中以极少量存在的蛋白质。 |
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其原理如图4B1所示，首先抗体特异性识别目标蛋白并与其结合。接下来，一个量子点亲和素与抗体上标记的生物素结合。量子点生物素与亲和素结合。下一个量子点 - 亲和素与生物素结合。如此反复进行，抗体上依次堆积大量量子点，荧光强度增强。图4示意性地表示了传统免疫印迹方法（A1，化学发光检测）和新开发的使用量子点的免疫印迹方法（B1，荧光检测）的原理。
通过这种方法参与细胞分裂端粒结合因子(TRF1，56KDa)TRF1 相互作用核蛋白2（Tin2，40kDa）。这些蛋白质在超过 90% 的慢性粒细胞白血病细胞中表达，但含量非常少。作为对照分析方法，进行了使用常规化学发光的免疫印迹。
结果发现，使用基于量子点的免疫印迹分析方法可以高灵敏度地检测到使用传统免疫印迹方法无法检测到的微量蛋白质（图4A2）（图4B2）。
此外，发现即使在市售荧光测量装置中连续测量时，量子点信号也能稳定约40分钟，因此适合于分析和获取检测数据。此外，如果保存在 4°C 并避光，荧光信号不会发生重大变化，并且可以稳定数周。
这些结果表明，作为检测痕量蛋白质的技术，使用量子点的“三明治型”免疫印迹优于传统免疫印迹。
我们计划与名古屋大学应用化学系马场良信教授（AIST健康工程研究中心副主任）合作，计划将这种新开发的量子点免疫印迹分析技术应用于开发利用微芯片电泳检测和识别天然蛋白质的电泳芯片。此外，我们计划开发一种量子点表面处理技术，专门标记食品制造过程（包括酿造和发酵）中产生或侵入的不良真菌和异物，并计划将该技术应用于评估技术以实现最佳过程控制。