国立先进产业科学技术研究所 [主席：Ryoji Chubachi]（以下简称“AIST”）生物医学研究部 [研究主任：Katsuhiro Omiya] 生物分析研究小组 佐佐木晃，首席研究员和 Naohiro Noda 研究小组组长：国立大学法人，北海道大学 [主席：Kazo Yamaguchi] 先进生命科学学院 Masataka Kinjo 与教授们，我们测定了RNA的浓度。绝对量化我们开发了一种方法8327_8339|
这次开发的技术是单分子成像方法荧光相关光谱 (FCS)荧光染色的RNA分子的数量来定量RNA浓度的技术。还，经过认证的参考资料（SRM和CRM）用于评估这种定量分析方法的有效性。这是一项突破性的分析技术，可以直接定量RNA浓度，而传统上，无论分子的序列或长度如何，都是以重量为基础进行的，有望成为提高RNA定量分析方法精度的基础技术。
该技术发表于2018年9月18日美国化学会期刊上分析化学发表在杂志上。
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开发的RNA定量分析方法的定位 PCR（聚合酶链式反应）是一种扩增核酸并根据扩增曲线定量核酸量的方法。 HPLC（高效液相色谱法）是一种通过在压力下使液体通过色谱柱来分离和检测液体的方法。 |
近年来，基因诊断和定制医疗备受关注。基因相关测试尽管在测试系统质量保证和数据方面正在取得快速进展标准化仍然不发达，这些标准化已成为基因相关测试的传播和可靠性保证的重要问题。标准化的挑战之一是缺乏有质量保证的标准样品。目前使用的大多数基因定量方法都涉及使用已知浓度的标准样品创建校准曲线并计算相对样品浓度。然而，诊断目标多样化，为所有检测目标制备标准样品并不现实。由于这种情况，定量值根据检测机构和检测日期的不同而不同，无法进行比较，这给保证基因诊断的可靠性带来了问题。因此，需要开发一种能够简单、直接地定量不同序列和长度的靶核酸数量的技术，以及应用该技术的核酸标准材料。
AIST 一直在促进新的基础药物发现技术的开发，以了解和阐明生物分子和细胞的功能。此外，日本国家计量院（AIST）还开发并发行了作为国家标准的“参考材料”。这次，我们与北海道大学合作开发了一种使用FCS对RNA进行绝对定量的方法。
请注意，该开发项目由经济产业省 2014 财年产业标准化推进项目（战略性国际标准化加速项目（国际标准联合研究、开发和传播基础设施建设项目））资助。该项目是新能源和技术研究所“开发利用植物等生物体生产高功能产品的技术/开发有助于创造高产微生物的信息分析系统”项目的一部分。产业技术开发机构（新能源及产业技术开发机构）。
FCS 是一种通过将激光照射到微小的测量区域并分析荧光分子移入和移出该区域时发生的“荧光强度波动”来测量分子数量和分子扩散速率的方法。原则上，可以计算生物分子的数量。然而，将分子数转换为通用浓度单位需要测量区域的精确体积。到目前为止，激光照射区域的形状是假设的，并且测量区域的体积是根据具有已知扩散率的荧光染料的FCS测量结果来估计的。然而，据报道，根据设备的类型，激光照射区域的形状的假设常常与实际形状不同，并且这不足以作为校准方法。这次，我们使用具有认证浓度值的标准物质（SRM、CRM）来确定准确的测量区域（图1）。 (日本 2016-217887）
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图1 使用标准材料的FCS校准方法概述
1 fL（飞升）是 0000000000001（万亿分之一）毫升。 |
该技术采用经过认证的标准物质（荧光染料）经过严格校准的FCS测量装置，直接对水溶液中荧光染色的RNA分子进行计数，从而确定分子的绝对数量。此外，通过比较认证值和使用AIST开发的核酸标准物质通过FCS测量的实际值，我们确认了这次开发的绝对定量分析方法是合适的（图2）。
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| 图2 使用该技术对RNA分子数量进行绝对定量 |
AIST 作为日本国家计量研究所，开发并分发测量中使用的标准物质（初级标准物质）。然而，由于开发标准材料需要数年时间并花费大量资金，因此为基因检测的众多目标中的每一个创建一系列标准材料是不切实际的。通过应用新开发的技术，对目前还没有标准物质的大量目标，为每个检测机构每次检测中使用的“实用标准物质”进行赋值，实现了基因检测的质量保证和使用校准曲线的传统定量方法的更高精度。国际单位制 (SI)（图3）。
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图3 各种实用标准在定价中的应用 迄今为止，只能确保由 AIST 等开发的主要标准物质的目标的可追溯性，但预计该技术将能够确保各种测试目标的实际标准物质的可追溯性。 |
利用新开发的技术，我们将创建可用于基因检测的实用RNA参考材料。此外，由于目标不限于RNA，因此有望成为通用的分子数定量技术，并将应用于DNA、蛋白质等的测量。此外，由于FCS具有与共焦荧光显微镜完全相同的系统配置，因此可以将荧光显微镜图像与定量浓度值精确关联，因此我们的目标是基于新开发的技术标准化荧光成像技术。
国立产业技术综合研究所
生物医学研究部生物分析研究组
首席研究员 Akira Sasaki 电子邮件：akirasasaki*aistgojp（发送前请将 * 更改为 @。）