国立产业技术综合研究所［理事长中钵良二］（以下简称“AIST”）环境管理研究部［研究主任田中干也］高级研究员金成培和庆应义塾大学［校长长谷山晃］（以下简称“庆应义塾大学”）理工学部［院长伊藤晃平］应用化学系铃木光治名誉教授、丹尼尔·奇特里奥教授、亮西原（博士课程）是生物发光酶8355_8389
生物发光酶大体相同发光基板例如，源自昆虫（包括萤火虫）的生物发光酶通常是D-荧光素成为共同的底物。然而，这种发光特性是生物测定使得很难使用超过一种生物发光酶。例如，当两种或多种生物发光酶从共同的底物发射光时，它们的发射光谱重叠，导致发光信号的污染。现有的滤光器难以将发光信号完全分离，即使能够分离，也存在发光的亮度减弱的问题。如果在生物测定中可以同时使用大量发光酶，则可以大大提高生物测定的效率，例如高样品通量。
作为颠覆传统智慧的新挑战，联合研究小组成功地对每种发光酶选择性发光的发光底物进行了分子设计和开发。结果，我们发现了一种源自海肾的发光酶（海肾荧光素酶； RLuc) 和发光浮游生物人工生物发光酶（人工荧光素酶； ALuc®9209_9248科学报告杂志(自然出版集团)。
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| 使用活体动物细胞（源自非洲绿猴肾）进行生物发光成像实验。在载玻片上培养表达各种发光酶的转化细胞。可以看出，即使将本研究开发的发光底物撒在整个载玻片上，也只有特定的发光酶会发光。用于比较的发光酶名称：GLuc、Gaussia生物发光酶； RLuc86-535，海肾生物发光酶； ALuc16，人工生物发光酶； CLuc，Cypridina生物发光酶； FLuc，萤火虫生物发光酶； CBg，绿色点击甲虫生物发光酶。组1和组3指的是图2的分类表中的组。 2(A)。 |
以萤火虫发射为代表生物发光广泛且常用，主要用于生物测定。萤火虫是生物发光的一个著名例子，但自然界中还有许多其他发光生物，例如发光浮游生物和海肾蘑菇。虽然生物发光通常对生物体无害，但它明亮且不需要滤光片，使其有利于检测装置的小型化，并且长期以来被用作生物测定和各种诊断试剂盒中的发光标记。
另一方面，与发光一样，荧光也是一种广泛应用于工业界和学术界的发光标记。从水母水母中分离出的荧光蛋白尤其著名。然而，为了诱导荧光信号，激发光照射是绝对必要的。然而，荧光是一个非常低效的系统，因为只有一小部分激发光被转换成荧光信号，其余大部分仍然作为背景。此外，部分激发光可能与荧光信号混合而造成污染，并且还存在由于强激发光照射（通常使用激光）而破坏生物体的问题。由于这个原因，背景荧光总是很高，并且检测系统变得复杂，因为需要配备激发光振荡装置和滤光器。除了这些限制之外，还存在难以在难以照射激发光的系统（例如身体的深处）、具有天然高荧光背景的系统（例如脂溶性环境（胚胎、脂肪组织等））以及紧凑的诊断试剂系统（小型化）中使用的问题。
尽管生物发光有着悠久的历史，但仍存在一些阻碍其工业应用的弱点。例如，与荧光不同，生物发光具有发射光谱 (半宽）较厚（图1（A）），不同发光信号之间容易发生污染（串扰）。此外，虽然发光需要称为底物的化学物质，但是发光酶能够使用的发光底物的种类有限，并且存在多种不同的发光酶能够利用相同的发光底物发光的问题。例如，源自昆虫（包括萤火虫）的发光酶通常使用 D-荧光素作为常见底物。同样，来自海洋生物（包括海肾）的发光酶通常以腔肠素作为常见底物。此外，发射的光的颜色并不多样化：例如，大多数发射的光颜色发射蓝绿色区域的光，而发射波长比黄色更长的光的情况很少。在极少数情况下会发出红光（例如铁路虫子）。对于源自海洋生物的发光酶来说，这种趋势尤其强烈。
由于生物发光的特性（宽半宽度、有限的发光颜色），在由两种或多种发光酶组成的生物系统中，发光信号之间一定程度的污染被认为是不可避免的。为了解决这个问题，可以使用滤光器来分离颜色，但是在这种情况下，发射光的亮度显着减弱并且检测光学系统变得复杂。
这些问题在使用生物发光时经常发生，并且只要使用生物发光就很难避免这些问题。
本研究是在科学研究补助金A、科学研究补助金B、挑战探索性研究等（日本学术振兴会）的研究资助下进行的。
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| 图 1(A) 典型生物发光酶的发射光谱。主要发出蓝绿色区域的光，但根据与基板的组合，也可以发出600nm以上的红色波长区域的光。 (B) 源自海洋生物的生物发光酶的超二级3D结构（海肾生物发光酶（RLuc）、人工生物发光酶（ALuc30））。对于相同的底物（腔肠素（CTZ）），每种发光酶的结合模型是不同的。 |
我们的联合研究团队一直致力于开发专门针对每种发光酶发光的底物，以解决上述生物发光的基本问题。
一、发光浮游生物（桡足类）的人工生物发光酶（ALuc®）的超二级3D结构（图1（B）；参考论文1）。对该三维结构的分析揭示了以下内容： 酶活性位点靠近 C 末端。此外，“底物的C-2残基”位于酶活性位点较深的位置，而“底物的C-6残基”位于酶活性位点的入口附近。这表明，虽然“底物 C-2 残基”与酶活性位点紧密结合，但“底物 C-6 残基”的结合相对松散。另一方面，先前已知的RLuc8的三维结构则相反：“底物的C-2残基”松散地结合，而“底物的C-6残基”与酶活性位点紧密结合（参考文献2）。
生物发光酶的这些结构特征表明，可以通过调整“底物的C-2或C-6残基”来产生发光酶特异性的发光底物。
如图2(A)所示，我们合成了20种发光底物，并利用动物细胞中表达的发光酶研究了它们的发光特性。其结果是，得到图1所示的结果。获得图2(B)。也就是说，每种发光底物对每种发光酶表现出不同的选择性。例如，发光底物②、③和④与人工生物发光酶（ALuc®）特异性发光，而发光底物⑮仅与海肾发光酶（RLuc86-535）选择性发光。发现发光底物⑨的ALuc®和RLuc86-535均发出强光。
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| 图2 (A) 合成的发光底物的化学结构。红色部分是与原始发光底物（天然腔肠素）不同的官能团。 (B) 由于合成的发光底物而导致的发光酶的相对发光强度。为了方便起见，合成发光底物根据其化学结构分为五类。 ：第1组在C-6位含有乙炔基。第2组的特征在于C-2苯环上具有羟基(OH)。 Cypridina荧光素酶(RLuc86-535)特异的发光底物(6piOH-2H-CTZ)的特征是C-2位不具有官能团，而C-6位具有OH基团。 |
图2的结果表明，在多种发光酶共存的复杂系统中，可以选择性地使一种发光酶发光。基于这一结果，我们进行了进一步的实验，以验证在动物细胞系统中是否可以获得类似的结果。首先，将源自非洲绿猴肾脏的COS-7细胞在6通道微型载玻片上培养，然后表达每种发光酶。如图3所示，制备了三块微玻片，其中每个通道表达六种不同类型的发光酶。然后，将图 2 中显示选择性的底物 (③、⑮、⑨) 引入三个显微载玻片中。人工生物发光酶 (ALuc16) 使用发光底物 ③ 选择性发光。另一方面，海肾荧光素酶由于发光底物⑮而选择性地发光。然而，当添加发光底物⑨时，预计两者都会发光，但实际上，人工生物发光酶（ALuc16）发出更强烈的光。这种结果差异可以通过细胞裂解系统（图 2）和活细胞系统（图 3）的独特特征来解释。例如，在活细胞系统中，由于存在细胞膜，因此存在容易透过细胞膜的发光底物和不易透过细胞膜的发光底物，从而影响发光亮度。在细胞裂解系统中，反应溶液的 pH 值设置在酸性范围内。先前的研究已经表明，酸性pH值会更强烈地抑制人工生物发光酶的亮度。因此，在图2所示的实验中，人工生物发光酶(ALuc16)和海肾发光酶的亮度似乎相似。
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| 图3 (A) 在活体动物细胞环境中对发光酶（发光底物）具有选择性的生物发光成像。根据喷涂的发光底物，特定的发光酶选择性地发光。 (B) 上述活体动物细胞的生物发光亮度随时间的变化。海肾生物发光酶（RLuc86-535；定位于细胞质）很快失去发光亮度，而人工生物发光酶（ALuc16；定位于细胞内质网）发光亮度先增加后降低（发光延迟）。这一结果似乎是由于细胞质中的定位差异所致：人工生物发光酶选择性的发光底物两次穿过细胞膜，与内质网中的发光酶相遇，因此表现出忽高忽低的发光亮度。本实验使用的发光酶种类：高斯生物发光酶（GLuc）； Cypridina生物发光酶(RLuc86-535)；人工生物发光酶16（ALuc16）； Cypridina生物发光酶（CLuc）；萤火虫生物发光酶（FLuc）；单击甲虫生物发光酶绿色 (CBg)。 |
为了验证本研究开发的发光底物的特异性发光酶选择性，设计了更为复杂的生物测定系统，如图4所示。首先，我们课题组之前开发了两种发光底物分子应变传感器被引入相同的动物细胞并表达。每个分子应变传感器都包含人工生物发光酶 (ALuc23) 和海肾生物发光酶 (RLuc8)。该传感器的设计方式是，当它与（配体）结合时，传感器分子内的蛋白质之间会发生键合，从而对夹在它们之间的发光酶施加压力，从而增加发光亮度（称为开关1）。此外，通过添加本研究开发的发光基板，可以选择性地使其中一个传感器发光（称为开关2）。即，即使在多个开关1共存的复杂系统中，也能够使用开关2(选择基板)来选择性地调出光。该结果表明，即使在具有相同发射光谱的许多发光传感器共存的系统中，也可以精确定位每个发光信号。
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| 图4(A)可同时测定雷帕霉素（免疫毒性物质；Rapa）和雌性激素（Estrogen）的测定系统。将检测雷帕霉素的分子应变传感器（TP24；含有人工生物发光酶（ALuc23））和检测雌性激素抑制剂（OHT）的分子应变传感器（ERS；含有海肾发光酶（RLuc8））一起引入动物细胞中。当被多种化学物质污染的废水（样本）喷洒到细胞上时，这些化合物可能具有类似雌性激素的活性或类似雷帕霉素的免疫毒性（开关1）。在该系统中，基板对每个传感器都具有选择性，因此可以测量每个传感器的活性，而不会在传感器之间造成污染。 (B) 是结果。可以测量免疫毒性物质（Rapa；红条）和雌性激素抑制剂（OHT；绿条）的活性，这两种物质混合在一起，没有任何发光污染。缩写：Rapa，雷帕霉素； FRB，雷帕霉素结合蛋白之一（源自 mTOR）； FKBP，雷帕霉素结合蛋白之一； ER LBD，女性激素受体的配体结合域； SH2，v-Src 的 SH2 结构域； OHT，女性荷尔蒙抗癌药。 |
这项研究是解决生物发光污染这一根本问题的研究成果。利用这一结果，可以将一种紧凑的生物测定试剂盒商业化，该试剂盒可以同时测量多种激素和生理活性物质。传统技术一次只能检测到一个发光信号，但这项研究的成功使得首次创造出一种高效的生物测定试剂盒，可以一次测量多个发光信号而不会受到污染。此外，现在可以通过使用大量发光酶来高效地实现受影响区域的多色成像。
我们计划基于这一结果合成进一步的高性能发光底物。例如，开发发射更长波长光的发光基质将改善发光信号的组织穿透性。此外，我们希望阐明人工生物发光酶的三维结构将为理解生物发光中涉及的发光反应提供重要线索。
国立产业技术综合研究所
环境管理研究部环境微生物研究组
高级研究员 Seiba Kimu 电子邮件：kimu-sb*aistgojp（发送前请将 * 更改为 @。）