产量增加 90 倍！从曲霉中生产游离脂肪酸 Aspergillus

产量增加 90 倍！从曲霉中生产游离脂肪酸 Aspergillus

2019/03/31

产量增加 90 倍！从曲霉菌中产生游离脂肪酸作为药品和功能性食品的原材料，未来正在扩展

米曲霉是日本人熟悉的微生物，用于生产清酒、酱油和味噌。 2005，曲霉菌基因组解码已经完成并且研究正在加速，AIST 通过基因重组和改进的培养基实现了这一目标将游离脂肪酸产量提高 90 倍我成功地实现了这一目标。这种游离脂肪酸是曲霉产生的有用物质之一，含有亚油酸等必需脂肪酸。此外，类二十烷酸（主要控制炎症的生理活性物质）是通过必需脂肪酸的代谢产生的，因此未来将使用类二十烷酸作为原料。医药原料及功能材料高效生产生产的可能性大大增加了。

基因组解码的完成可以实现理论和高效的改进

　“代谢”是利用酶等分解物质并产生与原始物质不同的物质的过程。微生物通过代谢产生的各种物质被广泛用作食品、药品、生物燃料、抗菌剂、表面活性剂等的原料。

　日本人特别熟悉的一种微生物是一种名为米曲霉的丝状真菌。所有传统的发酵食品，包括清酒、味噌、酱油，甚至味醂和醋，都是通过曲霉菌的作用酿造的。曲霉的分解酶分解原料中所含的蛋白质、碳水化合物和脂类，产生氨基酸、葡萄糖和脂肪酸。此时，酵母菌、醋酸菌等其他微生物也被激活，产生酒精、风味成分和醋酸，从而产生具有独特香气和味道的发酵食品。

　曲霉菌的用途范围不仅限于食品。由于它具有大量生产多种酶的能力，因此生产食品加工用的淀粉酶、蛋白酶、果胶酶等酶，以及纺织工业用的淀粉酶、纤维素酶等工业用酶剂。

　为了从米曲霉中生产这些有用的物质，众所周知，改良米曲霉会比自然发酵产生更好的结果。然而，以前的改良方法是用紫外线照射曲霉菌，使未特指的基因发生突变，有时培育出1000多个菌株，并在其中寻找优良菌株。因此，所需的时间和精力是巨大的。

　2005年，情况彻底改变。同年，产业研究院也参与的产学官联合体完成了曲霉菌全基因组的解码。玉野浩一期待着解码基因组。

　加入AIST后，我想做对工业界有用的研究。我选择的主题是Aspergillus Aspergillus。随着Aspergillus Aspergillus的基因组测序完成，我们终于能够从理论上有效地生产Aspergillus Aspergillus产生的有用物质。”

　一旦基因组被解码，就可以预测每个基因的作用，例如“这个基因是参与新陈代谢的酶”，以及它将在哪里发挥作用，从而可以从一开始就进行有针对性的基因操作。

　通过利用基因组信息，现在可以轻松地进行基因重组，以提高先前生产的有用物质的生产效率或生产未知的有用物质，预计曲霉的利用可能性将大大扩展。''

停止新陈代谢并积累大量游离脂肪酸

　米曲霉的脂质含量高达57%。脂质具有广泛的应用，并且有望具有多种用途，例如用作燃料的油，以及生产用于食品和药品的必需脂肪酸。玉野首先决定研究从米曲霉中生产脂质。

　有些丝状真菌的脂质含量较高，但我们认为最好使用曲霉，因为它的酶生产率高且易于基因改造。起初，我们认为最好使用曲霉从这种脂质生产脂肪酸并将其应用于生物燃料。然而，由于产能、价格等原因，市场对生物燃料的需求仍然不够。因此，我们决定转变方向，利用米曲霉的高安全性来生产游离脂肪酸，生产药品、保健品等原料。

　曲霉产生游离脂肪酸也是由于“代谢”或“连续的物质转化反应”。

　曲霉 曲霉在代谢过程中会产生游离脂肪酸，但如果要用于工业，它必须能够高效地大量生产。我决定对曲霉进行基因改造来改进它，使其能够更高效地获取游离脂肪酸。”

　曲霉将葡萄糖转化为游离脂肪酸，但转化途径非常复杂。玉野反复考虑可以改变该途径的哪一部分来提高游离脂肪酸的生产率。

　我们首先关注的是游离脂肪酸产生后持续的反应。一旦形成游离脂肪酸，转化反应就不会停止；它们被转化为一种叫做酰基辅酶A的物质，然后通过β-氧化进一步转化为一种叫做乙酰辅酶A的物质。乙酰辅酶A被发送到代谢途径上游的柠檬酸循环，并遵循相同的途径直到产生游离脂肪酸。换句话说，产生的材料被回收并重复转化反应。

　我们认为，如果我们能够停止从游离脂肪酸开始的分解反应，游离脂肪酸将在细胞内积聚并可以大量产生。

Tamano利用曲霉属基因组信息识别出将游离脂肪酸分解为酰基辅酶A的基因faaA，并通过基因重组删除该基因，创建了分解反应不首先从游离脂肪酸进行的曲霉属菌株。通过改进下游筑坝方法，我们能够将游离脂肪酸的生产率提高到改进前曲霉菌株的92倍。

产量提升90倍，使工业化应用成为可能

　然而，这还不够。在代谢途径的上游，有一个称为“启动子”的部分，在从 DNA 转录为 RNA 时发挥作用。改变DNA序列的这个关键部分将会改变整个通路，所以效果应该会更大。除了阻断下游，我们还想到了激活上游，以便能够大量产生产生游离脂肪酸的酶。''

应该改变哪个基因才能实现这一目标？玉野查阅了各种文献并研究了对其他微生物有效的方法，如果他发现了一些似乎有潜力的东西，他就会对每一种微生物进行基因改造，并测量产生的游离脂肪酸的量。在不断的探索过程中，玉野发现了一种方法，可以用更强的酶基因取代将葡萄糖分解为丙酮酸的途径中的酶基因启动子。结果，我们成功表达了大量转酮醇酶，这是一种参与代谢的重要酶。通过提高其过量的产生，糖分解反应得到加强，结果可以产生更多的游离脂肪酸。

　　　生产力比之前提高了92倍，进一步提高了14倍，实现了比原来的曲霉生产力提高13倍。

　玉野还致力于通过改善培养条件（如培养液成分、温度和 pH 值）来提高生产率，同时致力于分泌曲霉细胞内积累的游离脂肪酸。到目前为止，游离脂肪酸是通过破坏细胞从细胞中提取出来的，但他们试图改进这一点，并创建一个系统，让游离脂肪酸自行从细胞中出来。

　我们在曲霉菌培养基中添加糖、氯化钙、氧化还原剂、表面活性剂等多种物质，观察是否分泌游离脂肪酸。大多数添加剂没有效果，但其中一种被发现可以分泌细菌细胞中90%的游离脂肪酸。浓度为 1% 的非离子表面活性剂 (Triton X-100)。

　通过这种方法，不需要破坏细胞来获取游离脂肪酸，因此曲霉可以在繁殖的同时继续产生游离脂肪酸。''

　通过在这种改进的培养基中培养改进的菌株，玉野能够每升生产 27 克游离脂肪酸。这实际上比自然存在的野生种群丰富 90 倍。如果能够大量生产，就可以充分用于工业用途。

旨在生产有助于新药开发的类二十烷酸

　基于这项可大规模生产游离脂肪酸的技术，玉野目前正致力于生产类二十烷酸，这种生理活性物质可用作药品和功能性食品的原材料。

　如果转化反应不停止，就会由葡萄糖生物合成各种类型的游离脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸。

　虽然米曲霉通常只产生亚油酸，但我们认为，通过整合曲霉所没有的酶基因，我们将能够创建新的代谢途径并产生结构更复杂的脂肪酸。”

　通过掺入去饱和酶，由亚油酸产生γ-亚麻酸，并且通过使用延伸酶，产生二高-γ-亚麻酸。然后另一种去饱和酶产生花生四烯酸。类二十烷酸是主要由花生四烯酸制成的物质的总称。

目前的药物使用多种通过各种方法产生的类二十烷酸，但如果我们通过基因重组引入以前未使用过的酶基因，应该可以产生具有新结构的类二十烷酸。此外，通过使用它，可以创造出具有前所未有的功能的新药物。该项目仍处于早期阶段，但如果一切顺利，预计将于2019年底投入实际使用。

　此外，我们计划将来采用基因组编辑代替基因重组。如果这成为现实，将有可能在更短的时间内创造出更多样的曲霉菌株。

　　通过基因重组和基因组编辑产生了各种各样的突变菌株，并从中产生了各种代谢物质。如果我们能够建立一个可以列出它们的库，这对于寻找具有新结构的有用物质的公司来说将具有广泛的用途。''

　我们目前正在与两家公司进行联合研究，研究如何从曲霉中创造新的有用物质并提高生产力。

　从类二十烷酸的例子中可以看出，这种方法不仅可以应用于游离脂肪酸，还可以应用于次级代谢物，因此我们相信它未来的应用范围非常广泛。如果您正在寻找具有这种功能的物质，或者如果您有任何由微生物生产这种物质的要求，请随时联系AIST。''

　米曲霉持续生产着日本人民不可或缺的食物，玉野觉得这些微生物的力量具有无限的可能性。